胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)摘取方法的研究*

王士杰 黃麗輝 雷靂 王鴻 范爾鐘 李穎

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(首都醫(yī)科大學(xué))(北京 100005)

背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)又稱脊神經(jīng)節(jié)，是軀體和內(nèi)臟感覺(jué)的初級(jí)中樞，富含感覺(jué)神經(jīng)元[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[2]，將背根神經(jīng)元植入耳蝸后，可以替代受損的感覺(jué)上皮并與螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成連接，具有初步的傳導(dǎo)功能，這為臨床治療感音神經(jīng)性聾帶來(lái)了希望。但采用文獻(xiàn)報(bào)道[3～7]的傳統(tǒng)摘取方法，操作難度相對(duì)較大，獲取神經(jīng)節(jié)數(shù)量相對(duì)較少。本研究探索了一種快速簡(jiǎn)便、實(shí)用性更強(qiáng)、效果更佳的背根神經(jīng)節(jié)摘取方法，為神經(jīng)元的體外培養(yǎng)和耳蝸移植研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 手術(shù)器械與動(dòng)物 Olympus體視顯微鏡1臺(tái)、組織鑷1把、組織剪1把、蚊式鉗1把、游絲鑷2把、眼科剪一把、直徑10 cm培養(yǎng)皿1個(gè)、與培養(yǎng)皿面積相符的硅膠1塊、注射針頭4個(gè)、懷孕17～18天的Wistar大鼠4只(共有胚胎大鼠50只)。

1.2 方法

1.2.1 胚胎大鼠的獲取 將懷孕17～18天的Wistar大鼠放入裝有乙醚的容器中進(jìn)行麻醉，待麻醉成功后頸椎脫臼快速致死。在大鼠下腹部“T”型剪開(kāi)皮膚及皮下組織，含有胚胎的“Y”型子宮顯露，剪開(kāi)子宮及胎膜，取出胚胎大鼠。實(shí)驗(yàn)分次進(jìn)行，共使用4只孕鼠，獲得了50只胚胎大鼠。分別以傳統(tǒng)方法和新方法各對(duì)25只胚胎大鼠摘取背根神經(jīng)節(jié)。

1.2.2 傳統(tǒng)方法摘取胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié) 剪除胚胎鼠的頭部、四肢以及腹部，獲取胚胎鼠的脊柱，然后將脊柱放入培養(yǎng)皿內(nèi)，在體視顯微鏡下打開(kāi)椎管及摘取神經(jīng)節(jié)。首先去除脊柱背側(cè)的皮膚及皮下組織，顯露椎骨。然后用游絲鑷輕輕逐個(gè)離斷椎弓，暴露椎管及脊髓。最后小心牽起脊髓，神經(jīng)節(jié)從椎間孔被帶出，然后逐個(gè)摘取(圖1)。

圖1 傳統(tǒng)方法摘取背根神經(jīng)節(jié) 方框內(nèi)為背根神經(jīng)節(jié)，黑色箭頭所指為脊髓，黃箭頭所指為椎骨

圖2 直接固定打開(kāi)椎管取出脊髓后 藍(lán)箭頭所指為神經(jīng)節(jié)，黃箭頭所指為椎骨

1.2.3 直接固定打開(kāi)椎管法摘取胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié) 將胚胎鼠按俯臥位直接放于培養(yǎng)皿內(nèi)的硅膠上，用注射針頭固定其四肢。首先用眼科剪沿胚胎大鼠的背部正中線剪開(kāi)皮膚(從尾椎至頸椎)，用游絲鑷小心向兩側(cè)分離皮膚，使椎骨暴露，椎管輪廓清晰可見(jiàn)。然后將胚胎鼠移至體視顯微鏡下，用眼科剪沿椎管走向從尾椎至頸椎剪開(kāi)椎骨，使脊髓充分暴露。然后用游絲鑷輕輕將脊髓取出，清理剩余的脊膜組織，再用眼科剪修剪椎骨，擴(kuò)大開(kāi)口，使圓形或橢圓形神經(jīng)節(jié)完全暴露。最后用游絲鑷從椎間孔內(nèi)將神經(jīng)節(jié)逐個(gè)取出(圖2)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別計(jì)算兩種方法的用時(shí)和摘取的神經(jīng)節(jié)數(shù)量。用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，以t檢驗(yàn)分析兩組之間的差異，P<0．05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

兩種方法摘取每只胎鼠平均用時(shí)、每只胎鼠平均獲得的神經(jīng)節(jié)數(shù)量、每分鐘獲得的神經(jīng)節(jié)數(shù)量和每個(gè)神經(jīng)節(jié)用時(shí)見(jiàn)表1，可見(jiàn)直接固定打開(kāi)椎管法摘取每只胎鼠的平均用時(shí)及摘取每個(gè)神經(jīng)節(jié)平均用時(shí)比傳統(tǒng)方法短，每只胎鼠獲得的神經(jīng)節(jié)數(shù)量及每分鐘獲得的神經(jīng)節(jié)數(shù)量多于傳統(tǒng)方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 兩種方法摘取背根神經(jīng)節(jié)的平均用時(shí)及摘取數(shù)量

注：與傳統(tǒng)方法比較，**P<0.01

3 討論

背根神經(jīng)節(jié)(DRG)位于椎管內(nèi)，在脊髓兩側(cè)，分布在椎間孔中，其表面被膜與脊膜相延續(xù)。頸部神經(jīng)節(jié)多呈梭形，胸、腰、骶節(jié)段的呈圓形或橢圓形，半透明、淺黃色[8]。由于其位置深在，體積細(xì)小，摘取有一定困難。而DRG取材時(shí)間長(zhǎng)短是影響DRG細(xì)胞培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素：只有減少細(xì)胞離體時(shí)間，才能保證培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的活性，活性良好的細(xì)胞才能用于下一步的耳蝸移植。因此，快速有效的摘取方法是細(xì)胞培養(yǎng)乃至細(xì)胞移植成功的最根本的基礎(chǔ)。

胚胎鼠背根神經(jīng)節(jié)摘取大致分為三步，本研究在這三個(gè)方面對(duì)操作加以改進(jìn)：第一步是脊柱的獲取與固定。傳統(tǒng)方法是只保留脊柱，將其余組織剪除，這樣不容易固定，使操作難度增大；而剪除這些不必要組織，需要耗費(fèi)一定的時(shí)間。本研究直接將胎鼠俯臥于硅膠上，用注射針頭固定四肢，同時(shí)將組織鑷從脊柱的腹側(cè)插入，利用組織鑷的彈性沿前后方向繃緊脊柱，起到進(jìn)一步的加固作用，這樣既節(jié)省了時(shí)間，又容易固定。第二步是打開(kāi)椎管的方式。傳統(tǒng)方法是用游絲鑷小心離斷椎弓，暴露脊髓，同時(shí)避免損傷脊髓，以免影響下一步的摘取。本研究直接用眼科剪沿椎管走向剪開(kāi)椎管，不必顧忌脊髓的損傷，既簡(jiǎn)單，又省時(shí)。第三步是胚胎鼠背根神經(jīng)節(jié)的摘取，傳統(tǒng)方法是牽起脊髓，將神經(jīng)節(jié)從椎間孔中帶出，然后用游絲鑷小心摘取，由于胎鼠脊膜質(zhì)地稚嫩，牽起時(shí)，神經(jīng)節(jié)不容易從椎間孔被帶出，即使被帶出，在摘取過(guò)程中，也極其容易斷離。鑒于此，本研究直接將脊髓從椎管內(nèi)取出，取出脊髓后，在椎間孔內(nèi)可以清晰地看到神經(jīng)節(jié)，非常容易摘取，既縮短了摘取所用的時(shí)間，又能獲得更多數(shù)量神經(jīng)節(jié)，極大的提高了摘取效率。

本研究改進(jìn)了胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)的摘取方法，與傳統(tǒng)方法相比，直接固定打開(kāi)椎管法摘取1只胚胎大鼠平均用時(shí)縮短約5分鐘，獲得的神經(jīng)節(jié)數(shù)量平均增加約10個(gè)；在相同的時(shí)間內(nèi)可獲得更多數(shù)量的背根神經(jīng)節(jié)。如果細(xì)胞培養(yǎng)需要相同數(shù)量的神經(jīng)節(jié)，直接固定打開(kāi)椎管法可在更短的時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的神經(jīng)節(jié)，從而縮短細(xì)胞離體時(shí)間，在一定程度上減少了細(xì)胞的損傷，能使細(xì)胞保持較高的活性，為下一步的細(xì)胞培養(yǎng)乃至移植奠定良好的基礎(chǔ)。

1 王麗琴，宋學(xué)琴，王曉娟，等.胚胎大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分離培養(yǎng)、純化及生物學(xué)特性研究[J].細(xì)胞生物學(xué)，2003，25:320.

2 Hu Z,Ulfendahl M,Prieskorn DM,et al.Functional evaluation of a cell replacement therapy in the inner ear[J].Otol Neurotol,2009,30:551.

3 Passmore GM.Dorsal root ganglion neurons in culture:A model system for identifying novel analgesic targets?[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2005,51 :201.

4 Tandrup T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival[J]. Journal of Neurocytology，2004，33:173.

5 Malin SA,Davis BM，Molliver DC.Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity[J]. Nature Protocols，2007，2 : 152.

6 熊南翔,趙洪祥,張方成.從大鼠活體取背根神經(jīng)節(jié)及交感神經(jīng)節(jié)的方法[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)，2006，16：367.

7 陳海亮,黃飛,張璐萍,等.背根神經(jīng)節(jié)摘取方法的研究[J].中外醫(yī)療，2008，27：1.

8 楊安峰，王平．大鼠的解剖和組織[M]．北京：科學(xué)出版社，1985.159～l 89．