大前庭水管綜合征家系SLC26A4基因傳遞特征分析△

王艷莉 郭玉芬,2 徐百成 袁逸銘 朱一鳴 歷建強 李倩 王秋菊

大前庭水管綜合征(large vestibular aqueduct syndrome, LVAS)是一種臨床常見的隱性遺傳性非綜合征型聽力障礙性疾病，在兒童和青少年感音神經(jīng)性聾中占1%～12%[1，2]。它是先天性內(nèi)耳畸形的一種。臨床上將只有前庭水管擴大畸形，不伴有其他內(nèi)耳發(fā)育異常和其他器官系統(tǒng)的異常(如pendred’s Syndrome, Branchiootorenal Syndrome)，合并感音神經(jīng)性聽力損失的患者診斷為大前庭水管綜合征。其致病基因與Pendred綜合征的致病基因相同,即SLC26A4, 定位于人類染色體7q31上，編碼Pendrin蛋白[3]。為了明確SLC26A4基因在大前庭水管綜合征家系親子代間的傳遞規(guī)律，闡明家系中患者的發(fā)病率及患者后代的發(fā)病情況，本研究收集3個大前庭水管綜合征家系，對其SLC26A4基因的傳遞特征進行分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料的收集 所有家系資料均來自蘭州大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科門診，該項目的倫理論證由中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會認可。本研究共收集3個大前庭水管綜合征家系，分別命名為502家系、506家系和513家系。影像學檢查發(fā)現(xiàn)5名大前庭水管綜合征患者，包括男性1名，女性4名。

所有納入者均進行了詳細的病史調(diào)查和系統(tǒng)的全身體格檢查，并根據(jù)各成員檢測年齡及配合程度分別行純音測聽、聽性腦干反應(auditory brainstem response, ABR)及畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emission, DPOAE)檢查。臨床病史資料的收集、家系各成員耳部檢查及聽力學檢查由蘭州大學第二醫(yī)院耳鼻喉科專業(yè)醫(yī)師完成。所有聽力損失患者均行顳骨軸位高分辨率CT掃描。經(jīng)各成員本人或其監(jiān)護人知情同意后抽取外周靜脈血5 ml。用Cyrillic2.1軟件繪制家系圖譜(圖1)。對大前庭水管綜合征患者進行隨訪，反復檢查其聽力。

圖1 502、506、513家系圖譜

1.2聽力學檢查方法 純音測聽：運用Madsen502便攜式聽力計，以0.5、1、2、4 kHz的平均聽閾作為聽力損失的分級標準，參照世界衛(wèi)生組織(WHO)標準[4]將聽力減退劃分為5級，即正?！?5 dB HL,輕度：26～40 dB HL，中度：41～60 dB HL；重度：61～80 dB HL；極重度≥81 dB HL。ABR和DPOAE應用美國智聽公司Smart EP 聽覺誘發(fā)電位儀，常規(guī)進行測試。

1.3影像學檢查 顳骨高分辨率軸位CT示：從半規(guī)管總腳到前庭水管外口的1/2處直徑大于1.5 mm，即診斷為前庭導水管擴大(EVA)[5]。

1.4基因組DNA提取 應用鹽析法在全血中提取基因組DNA，TE溶解，經(jīng)瓊脂糖電泳和紫外分光光度計定量和純度分析后分裝，-20℃保存。

1.5PCR反應 應用在線引物設(shè)計軟件Primer 3針對外顯子8、19和其內(nèi)含子的側(cè)翼序列設(shè)計引物，所有引物由invitrogen公司合成。聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction ，PCR) 采用25 μl反應體系,10×Buffer 2.5 μl,2.5 mM dNTP 2 μl,10 μM引物0.6 μl,Tag酶1.5 U,gDNA 100 ng,加去離子水至25 μl。外顯子的引物設(shè)計和反應條件參照wang等[6]所述。取2 μl進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測PCR產(chǎn)物。

1.6PCR產(chǎn)物的測序分析 用Millipore純化板對PCR產(chǎn)物進行純化,去除多余dNTPs和引物后應用ABI公司 3 730DNA測序儀進行正向和反向直接測序,引物與PCR擴增引物相同。測序結(jié)果與來自NCBI上的SLC26A4基因標準序列(NT_007933)在DNAStar 7.0和Sequencher 4.9上進行對比分析，確定突變位點。

1.7家系其他成員的基因檢測 針對患者中檢測到的SLC26A4基因突變位點，進行對應的序列分析。

2 結(jié)果

2.1顳骨高分辨率軸位CT檢查結(jié)果 顳骨CT共發(fā)現(xiàn)5名大前庭水管綜合征患者，未合并其他內(nèi)耳畸形(圖2)。

圖2顳骨CT圖A:正常雙側(cè)前庭水管；B:502家系先證者雙側(cè)擴大的前庭水管(箭頭所示)；C: 502家系患者Ⅲ:4雙側(cè)擴大的前庭水管(箭頭所示)；D: 513家系先證者雙側(cè)擴大的前庭水管(箭頭所示)

2.2臨床檢查結(jié)果 經(jīng)過系統(tǒng)的全身體格檢查，所有納入者僅表現(xiàn)為聽力損失，未見其它系統(tǒng)的異常。3個家系中，父母均正常，患者為同胞，無其他大前庭水管綜合征患者。5名大前庭水管綜合征患者發(fā)病時均不超過3歲，最小3個月，平均1.8歲，只有簡單言語發(fā)育。

2.3聽力學檢查結(jié)果 所有大前庭水管綜合征患者的聽力損失程度均達重度或極重度。家系各成員的聽力損失情況見表1。

2.4SLC26A4基因檢測結(jié)果 本研究共發(fā)現(xiàn)2種SLC26A4基因的突變類型，即IVS7-2A>G和H723R。5名大前庭水管綜合征患者均檢測出雙等位基因的突變，患者父母為單個突變基因的攜帶者。家系各成員的基因型見表1。

表1 家系成員聽力情況及其SLC26A4基因檢測結(jié)果

注：*即wild type，野生基因型

3 討論

本研究對3個大前庭水管綜合征家系15名成員的SLC26A4基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)5名成員攜帶SLC26A4雙等位基因突變，7名成員攜帶單個等位基因突變，3名正常人。檢測到兩種SLC26A4基因突變類型，即IVS7-2A>G和H723R，這兩種突變類型在國人大前庭水管綜合征患者中最常見[6，7]。IVS7-2A>G位于外顯子8剪切位點的位置，即內(nèi)含子7的3’末端，其突變使前體mRNA不能正常剪接，外顯子8整個丟失，外顯子7和外顯子9直接相連，從而導致Pendrin的翻譯發(fā)生移框或提前終止，影響Pendrin的結(jié)構(gòu)和功能[8]。H723R突變使該位置正常的組氨酸變成精氨酸，影響Pendrin的表達而致病[9]。

在502家系中，先證者Ⅲ:3、雙胞胎妹妹Ⅲ:4和其同胞弟弟Ⅲ:5的SLC26A4基因檢測結(jié)果均為IVS7-2A>G和H723R的復合雜合突變。父母(Ⅱ:3、Ⅱ:4)聽力正常，但分別為IVS7-2A>G和H723R的攜帶者。祖父Ⅰ:1和祖母Ⅰ:2聽力正常，但祖父是IVS7-2A>G突變的攜帶者，祖母未攜帶致病基因。同胞姐姐Ⅲ:1和Ⅲ:2聽力正常，均未攜帶致病基因。506家系和513家系的構(gòu)成相似：兩家系先證者的基因型均為IVS7-2A>G的純合突變，父母聽力均正常，都為IVS7-2A>G雜合突變攜帶者，506家系先證者的同胞姐姐和513家系先證者的同胞弟弟聽力均正常，血樣未獲得。由遺傳規(guī)律可知，子代的染色體分別來自父母雙方，分析502家系圖譜和各成員的基因型，可以得出如下結(jié)論：先證者的祖父攜帶的IVS7-2A>G突變傳遞給了先證者的父親，當他與攜帶H723R突變的先證者母親婚配時，兩者各自的致病突變分別會遺傳給子代，當患者同時遺傳了父母雙方各自的致病基因，組成自身染色體時就會導致患病。由此可見，SLC26A4突變的等位基因會穩(wěn)定的由親代向子代傳遞，506家系和513家系的SLC26A4基因同樣具有這種遺傳特征。

大前庭水管綜合征屬于常染色體隱性遺傳病，家系中常僅見一代人發(fā)病，先證者的父母為無臨床癥狀的單個突變攜帶者，患者常攜帶雙等位基因突變。上述3個家系中，均僅見一代人發(fā)病，父母聽力都正常，但均為致病基因的攜帶者，其子代中既有大前庭水管綜合征患者，又有聽力完全正常者，且患者中有男性也有女性，這些特點均符合大前庭水管綜合征的遺傳特征。根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律，兩個攜帶者婚配后，其子代中患者、攜帶者和正常者的發(fā)生幾率分別為25%、50%和25%。由此可以預測，506家系先證者的同胞姐姐和513家系先證者的同胞弟弟為IVS7-2A>G攜帶者的幾率為67%，完全正常的幾率為33%[10]。本研究502家系的子代中未發(fā)現(xiàn)致病基因的攜帶者，患者的發(fā)病幾率是60%(3/5)，506家系和513家系中患者的幾率均為50%(1/2)，均較理論值25%高。那么，先證者父母再生育一個大前庭水管綜合征患兒的幾率可能會低于25%。因而，臨床醫(yī)生在對大前庭水管綜合征家系再生育一個患者的風險進行評估時應謹慎。

大前庭水管綜合征的致病基因會由親代向子代穩(wěn)定的遺傳，上述3個家系中患者的致病基因同樣會遺傳給其后代，若她(或他)與正常人婚配，其子代均為攜帶者；若與攜帶者婚配，子代為攜帶者或患者，且患者的幾率較兩個攜帶者婚配后子代患病的幾率增加一倍。因此，倘若婚前進行SLC26A4基因的檢測，查明致病突變，并給予積極的遺傳指導或進行產(chǎn)前診斷，就可以對大前庭水管綜合征聾兒的出生做出早期預警，從而減輕家庭和社會的負擔。

近年來，國內(nèi)學者已在SLC26A4基因熱點突變及突變頻率、遺傳特征等方面進行了比較全面、深入的研究[6，7,11，12]。在此基礎(chǔ)上本研究又對3個大前庭水管綜合征家系的SLC26A4基因進行序列分析，查明了各家系成員的基因型，明確了各家系的致聾原因，并闡述了該基因由親代向子代穩(wěn)定傳遞的規(guī)律，明確了502、506和513家系中子代的患病幾率分別為60%、50%和50%，均高于理論值25%；同時對患者與不同類型的配偶婚后所生子代發(fā)病情況進行預測、分析，若給予積極的遺傳咨詢和適當?shù)呐R床指導，及早進行預防和干預，就可以降低耳聾的發(fā)生率，提高患者生活質(zhì)量。

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