幽門螺桿菌 NCTC11637、NCTC11639毒素相關(guān)基因A的克隆、序列分析及真核表達載體的構(gòu)建＊

汪 蘇,周建獎,單可人,趙 燕,謝 淵

1994年世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)正式將幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H p)列為Ⅰ類生物致癌因子。大量研究表明,幽門螺桿菌是慢性胃炎和消化性潰瘍的致病菌,也是胃癌的致病因子之一,H p的致病機理仍不清楚。幽門螺桿菌分泌許多毒力蛋白,其中毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)表達的蛋白CagA得到特別的關(guān)注。許多幽門螺桿菌菌株都能分泌CagA,CagA廣泛存在于60%～70%的H p菌株中。許多流行病學研究也表明CagA陽性的H p菌株感染同萎縮性胃炎、十二指腸疾病和胃癌之間有顯著相關(guān)。本實驗以H p國際標準株NCTC11 637、NCTC11 639的基因組 DNA為模板進行PCR。PCR產(chǎn)物采用 TA法克隆CagA全長基因,測序并進行序列分析。根據(jù)測序結(jié)果選擇PstI、B amHI兩個酶切位點進行雙酶切,連入真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(-)中構(gòu)建了CagA真核表達載體pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA 3.1 ZEO(-)/CagA9。

1 材料與方法

1.1 幽門螺桿菌國際標準菌株 NCTC11 637、NCTC11 639由中國幽門螺桿菌菌株管理與保藏中心提供;pMD18-T原核克隆載體購于 TaKaRa公司,pcDNA3.1/ZEO(-)真核表達載體購于 Invitrogen公司;CagA的PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 幽門螺桿菌CagA基因片段的制備 采用 PCR的方法制備CagA基因片段:(1)幽門螺桿菌基因組DNA的制備:幽門螺桿菌NCTC11637、NCTC11639于哥倫比亞血瓊脂37℃微需氧培養(yǎng)3d,提取菌株DNA作為 PCR模板。(2)CagA基因片段的 PCR制備:上游引物:5′-AC AAT GAC TAA CGA AAC CA-3′;下 游 引 物 :5′-TTT TGG TAT TCC TTA ATC CT-3′〔1〕。以上述模板 ,采用高保真酶,重復30次循環(huán),PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳,約3 500bp條帶即為目的DNA。

1.3 CagA基因的原核載體的構(gòu)建-TA克隆 CagA PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收CagA片段,并在3′末端加A。將CagA加A產(chǎn)物和pMD18-T原核質(zhì)粒16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α(CaCl2法制備),涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過夜。挑選轉(zhuǎn)化子,置于LB培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)過夜,通過煮沸裂解法提取質(zhì)粒初步鑒定陽性重組克隆,并進行CagAPCR擴增,1%瓊脂糖電泳,約有3 500bp條帶者疑為陽性克隆,陽性克隆分別命名為 pMD18-T/CagA7和 pMD18-T/CagA9。送TaKaRa公司測序,并根據(jù)測序結(jié)果選擇PstI、Bam HI兩個位點進行雙酶切鑒定。

1.4CagA基因真核載體構(gòu)建 pMD18-T/CagA7和pMD18-T/CagA9分別進行PstI、BamHI雙酶切1%瓊脂糖凝膠電泳后,切取CagA目的基因進行切膠純化。真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(-)同樣分別選取PstI、Bam HI兩個位點酶切后進行切膠純化。將目的基因和酶切純化的pcDNA3.1/ZEO(-)16℃連接過夜,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板,37℃培養(yǎng)過夜。用煮沸裂解法提取質(zhì)粒初步判定為陽性克隆后,挑取陽性克隆,用雙酶切和CagAPCR擴增鑒定陽性克隆。分別命名為pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7、pcDNA3.1 ZEO(-)/CagA9。

1.5 pcDNA3.1ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染胃癌細胞 人胃癌細胞株AGS購于中科院上海細胞庫,常規(guī)培養(yǎng)24h后用構(gòu)建的pcDNA3.1ZEO(-)/CagA真核表達載體轉(zhuǎn)染,根據(jù) Invitrogen公司Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作,48h后收集細胞,提取RNA和蛋白進行鑒定。

1.6 Western blot檢測CagA蛋白的表達 提取細胞蛋白,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜,膜在5%封閉液中室溫孵育1h后加入一抗(兔多抗CagA,1∶500稀釋)4℃過夜,TBST洗膜3次,每次10min,再加入 HRP標記的二抗,室溫孵育膜2h,TBST洗膜2次,每次15min,TBS洗膜1次,15min;以 GAPDH作為對照,ECL室溫孵育5min,膠片曝光顯影。

1.7 細胞總RNA的提取及cDNA逆轉(zhuǎn) 細胞采用 Trizol提取總 RNA,取 2000 ng的 mRNA,加入 Oligo dT18(10 pmol/μL)混勻后放置65℃水浴5min,迅速取出轉(zhuǎn)置冰上,加入 dNTPs(10 mmol/μL)2.5μL;5 ×buffer 5μL;MMV(200 U/μL)1μL;RNA 酶抑制劑 (40 U/μL)0.5μL;加DEPC處理水至25μL。進行逆轉(zhuǎn)錄反應,反應條件:37℃60 min,75℃60 min,所得cDNA于-20℃保存。根據(jù)文獻設(shè)計 CagA 引物〔4〕。上游引物:5′-AAT ACA CCA ACG CCT CCA AG-3′;下游引物 :5′-TTG TTG CCG CTT TTG CTC TC-3′。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳,約397bp條帶即為目的DNA。

1.8 實時熒光定量 PCR 胃泌素及β-actin檢測試劑由ABI公司提供,按說明書操作。反應條件:50℃2min,95℃10min,95℃15s,60℃1min,40個循環(huán),數(shù)據(jù)采用 ABI7300 SDS Software分析。

1.9 相對mRNA表達水平的計算 采集胃泌素及β-actin基因各循環(huán)熒光信號,用 SDS1.4軟件計算Ct值、△△Ct值及相對表達值 RQ〔5〕,△△Ct=(Ctgastrin-Ctβ-actin)處理組 -(Ctgastrin-Ctβ-actin)對照組 ,RQ=2-△△Ct。

1.10 統(tǒng)計處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,采用 SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析,P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 NCTC11 637、NCTC11 639CagA基因片段的制備 提取NCTC11 637菌株及NCTC11 639菌株DNA后,用CagA引物進行 PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳,在約3 500bp處得到CagA目的條帶,見圖1A。

2.2 pMD18-T/CagA原核克隆載體的鑒定 用煮沸裂解法提取質(zhì)粒,初步鑒定為陽性重組克隆后,用質(zhì)粒小提試劑盒提取陽性克隆。用CagA引物進行PCR擴增,均得到約3 500bp的目的條帶,見圖1B,測序后選用PstI、B amHI進行雙酶切鑒定,見圖1C,在2 500bp～5 000bp之間得到兩條條帶。上方約3 500bp處為CagA目的片段,而下方2692bp處為pMD18-T原核載體。表明pMD18-T/CagA7和pMD18-T/CagA9原核克隆載體構(gòu)建成功。

圖1 原核載體pMD18-T/CagA的構(gòu)建和鑒定A:幽門螺桿菌 NCTC11 637和 NCTC11 639CagA PCR擴增電泳圖;B:原核載體pMD18-T/CagA CagA PCR鑒定電泳圖;C:原核載體pMD18-T/CagA PstI、Bam HI雙酶切鑒定電泳圖;M:marker;Hp11 637:幽門螺桿菌 NCTC11 637;Hp11 639:幽門螺桿菌NCTC11 639;CagA7:原核載體pMD18-T/CagA7;CagA9:原核載體pMD18-T/CagA9Fig.1 Construction and identification of prokaryotic vector pMD18-T/CagA

2.3 pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA 3.1 ZEO(-)/CagA9真核表達載體鑒定 用煮沸裂解法提取質(zhì)粒初步鑒定為陽性重組克隆后,用CagA引物進行 PCR擴增,均得到約3 500bp的目的條帶,見圖2A。同時用PstI、B amHI進行雙酶切鑒定,見圖2B,在2 500bp～5 000bp之間得到兩條條帶,其中上方5 000bp處為pcDNA3.1/ZEO(-)載體,下方約3 500bp處為CagA基因。結(jié)果表明幽門螺桿菌pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA3.1ZEO(-)/CagA9真核表達載體構(gòu)建成功。

圖2 真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA的鑒定A:真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA CagA PCR鑒定電泳圖;B:真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA PstI、Bam HI雙酶切鑒定電泳圖;M:marker;CagA7:真核表達載體 pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA7;CagA9:真核表達載體 pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA9Fig.2 Identification of eukaryotic vector pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA

2.4CagA基因序列測定和同源性分析 測序結(jié)果顯示:NCTC11 637中CagA基因全長為 3 467bp,NCTC11 639CagA基因全長為 3 594bp。將測序結(jié)果登錄 GenBank,登錄號分別為 GQ161 098(NCTC11 637)和 GQ161 099(NCTC11 639)。NCTC11 637CagA的序列與 GenBank收錄的NCTC11 637CagA序列(AB015 416)基本相符,核苷酸序列同源性達99.22%。NCTC11 639CagA全序列 GenBank未見收錄,而 NCTC1 1639CagA與本實驗構(gòu)建的NCTC11 637序列比對同源性為87.88%。

2.5 CagA蛋白酪氨酸磷酸化位點 CagA蛋白酪氨酸磷酸化位點在CagA基因的 EPIYA(Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala)模體上。根據(jù)pMD18-T/CagA7和pMD18-T/CagA9的測序結(jié)果,利用軟件分析 CagA蛋白的 EPIYA位點,顯示 NCTC11 637和NCTC 11 639CagA蛋白酪氨酸磷酸化位點各有兩個,分別為 NCTC11 637 EPIYA-A、-B和 NCTC11 637 EPIYA-A、-B。

2.6 pcDNA3.1ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染胃癌細胞AGS后CagA的表達 將構(gòu)建的真核表達載體pcDNA3.1ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染胃癌細胞株AGS 48h后提取細胞總RNA和細胞蛋白,分別用RTPCR和Western-blot檢測CagA mRNA和蛋白的表達,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后AGS細胞表達CagA,見圖3,表明pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

圖3 pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染胃癌細胞AGS后CagAmRNA(上部)和蛋白(下部)表達Con:未轉(zhuǎn)染的細胞對照;Vector:空載體轉(zhuǎn)染的細胞對照;CagA7:pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA7轉(zhuǎn)染;CagA9:pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA9轉(zhuǎn)染Fig.3 Expression of CagA mRNA(upper)and protein(down)in gastric cancer AGS cells transfected with pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA

2.7 pcDNA3.1ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染細胞后胃泌素mRNA表達 pcDNA3.1ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染AGS細胞后,以對照組胃泌素 mRNA的表達量為對照,各轉(zhuǎn)染組中胃泌素mRNA的相對表達量分別為:4.86±0.45(pcDNA3.1)、10.56±0.87(pcDNA3.1/CagA7)及10.63±0.84(pcDNA3.1/CagA9),見圖4。結(jié)果顯示CagA的轉(zhuǎn)染顯著增加了AGS細胞中胃泌素基因的表達(P<0.05)。

圖4 pcDNA3.1ZEO(-)/CagA轉(zhuǎn)染 AGS細胞后胃泌素mRNA表達Control:未轉(zhuǎn)染的細胞對照;pcDNA3.1:空載體轉(zhuǎn)染的細胞對照;pcDNA3.1/CagA7:pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA7轉(zhuǎn)染;pcDNA3.1/CagA9:pcDNA3.1/ZEO(-)/CagA9轉(zhuǎn)染;＊:與空載體轉(zhuǎn)染組比差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)Fig.4 The levels of gastrin mRNA in AGS cells transfected with the pcDNA3.1ZEO(-)/CagA

3 討 論

CagA基因編碼120～145×103Da的CagA蛋白,通過Ⅳ分泌系統(tǒng)輸送到胃上皮細胞,然后定位于細胞的漿膜面,轉(zhuǎn)位的CagA通過Src家族蛋白激酶(SFK)發(fā)生酪氨酸磷酸化后能與多種細胞蛋白作用,調(diào)控細胞生長和運動相關(guān)的信號通路,使細胞骨架重排、運動力增強,轉(zhuǎn)錄因子表達改變,導致細胞增殖〔2〕。磷酸化的CagA是其主要的活性形式,而CagA中酪氨酸磷酸化的位點主要發(fā)生在 EPYIA模體上。所以CagA的磷酸化水平與 EPIYA模體的數(shù)量相關(guān)。NCTC11 637和NCTC11 639為西方菌株,一些學者的研究發(fā)現(xiàn)NCTC11 637的CagA有 EPIYA-A、-B、-C、-C、-C 五個酪氨酸磷酸化位點〔3〕,但是我們的研究發(fā)現(xiàn) NCTC11 637的 CagA僅在羧基端有兩個酪氨酸磷酸化位點,即 EPIYAA、-B,也有日本學者發(fā)現(xiàn),NCTC11 637其羧基端只有兩個酪氨酸磷酸化位點〔4〕,與我們序列的同源性高達99.25%(AB015 416),因此我們認為CagA基因的異質(zhì)性可能與它的流行地區(qū)有關(guān)。而NCTC11 639的序列在 GenBank中未見收錄,我們將NCTC11639和NCTC11637測序序列比對發(fā)現(xiàn)兩者的同源性有87.88%,并且NCTC11 639也只有兩個酪氨酸磷酸化位點 EPIYA-A和 EPIYA-B。雖然有研究表明,分子量越大、磷酸化位點越多的CagA與H p菌株毒力高低和胃癌的關(guān)系更密切〔5〕,但是目前的流行病學研究發(fā)現(xiàn),胃癌的發(fā)病率在中國、日本等亞洲國家逐年增加,而歐美國家逐年下降,這種差異是否與不同地區(qū)的流行菌株和CagA的酪氨酸磷酸化位點有關(guān)尚待進一步研究。

本研究采用T-A克隆法將PCR產(chǎn)物直接克隆到原核載體pMD18-T上,使用高保真酶確保了產(chǎn)物擴增的正確性。因為高保真酶的特殊性,產(chǎn)物需要在3′端加入一非模板來源的突出A。突出A則可與 T克隆載體的5′突出的 T互補配對,并被連接酶連接形成重組體。原核克隆載體構(gòu)建成功后,根據(jù)測序后限制性核酸內(nèi)切酶譜分析結(jié)果選擇單一酶切位點的兩個限制性核酸內(nèi)切酶,雙酶切原核克隆載體后連入真核表達載體pcDNA3.1/ZEO(-)中,成功構(gòu)建了NCTC 11 637和NCTC 11 639 CagA全長真核表達載體pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA3.1ZEO(-)/CagA9。隨后我們將構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞株A GS,并在AGS細胞中檢測到了CagAmRNA和蛋白質(zhì)的表達,并且發(fā)現(xiàn)AGS細胞中胃泌素基因的表達上調(diào),說明幽門螺桿菌毒素相關(guān)蛋白 CagA調(diào)控了胃泌素基因的表達。

幽門螺桿菌毒素相關(guān)蛋白CagA和胃泌素是胃癌發(fā)生發(fā)展的兩大重要因素,盡管過去的研究發(fā)現(xiàn)他們之間有一定的聯(lián)系,但迄今為止,尚無直接研究他們相互關(guān)系的文獻報道。而我們通過構(gòu)建含CagA基因的真核表達載體轉(zhuǎn)染胃癌細胞,用實時熒光定量PCR定量檢測胃泌素基因表達水平的變化來直接研究它們之間的相互作用,因此我們的研究首次將兩者直接聯(lián)系起來,證實了CagA是調(diào)控胃泌素基因表達的相關(guān)蛋白。

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