日本血吸蟲TβRII樣基因胞外段的克隆、表達及初步鑒定*

陳 姍,馬長玲,高志巖,麥璟瑩,趙晶晶,朱郇憫,李小敏,李 孜

轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)超家族成員在細胞的生長、分化、細胞外基質(zhì)的形成和免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用〔1-8〕。TβR(TGF-β受 體)有多 種,其 中 I 型(TβRI)、II型(TβRII)、III型(TβRIII)分布于多類細胞膜上。TβRI和 TβRII在 TGF-β信號轉(zhuǎn)導中起主導作用,TβRII具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,在生理濃度下可單獨與 TGF-β結(jié)合,結(jié)合后TβRII胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,再與 TβRI結(jié)合形成 TGF-β-TβRII-TβRI復合體,隨之 TβRI胞內(nèi)段發(fā)生磷酸化,引起下游smad蛋白家族的一系列變化,從而將信號傳遞于細胞胞核內(nèi)〔9-10〕,調(diào)控目的基因表達。

Osman等在曼氏血吸蟲發(fā)現(xiàn)了 TβRII(SmTβRII),該基因大約為26kb,由9個外顯子組成。序列比對表明,SmTβRII與哺乳動物(大鼠,小鼠,人)活性TβRII有一定的同源性。應用siRNA技術(shù),沉默SmTβRII,可引起抱雌溝蛋白(Gynecophoral canal protein,GCP)表達減少,表明SmTβRII通過激活 TGF-β信號通路誘導GCP表達,提示TGF-β信號通路在雄蟲促雌蟲發(fā)育成熟方面起著重要作用〔11〕。在此基礎上我們推測日本血吸蟲亦有可能存在 TβRII(SjTβRII),在蟲體自身發(fā)育和對宿主致病過程中發(fā)揮重要作用。本文通過RACE方法,獲得日本血吸蟲 TβRII樣基因全長cDNA序列,在生物信息學分析的基礎上,克隆、原核表達其N端(即胞外段),為進一步研究其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 E.coil BL21(DE3)菌種、原核表達載體pET28a(+)質(zhì)粒均由本教研室保存,pMD19-T Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2 實驗動物和釘螺 新西蘭大白兔購自廣東省實驗動物中心,陽性釘螺(Oncomelaniahupensis)購自江西省血吸蟲病防治研究所。

1.1.3 主要試劑 T RIzol試劑購自Invitrogen公司,Taq DNA聚合酶、RT-PCR試劑盒、Marker DL2000、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、蛋白質(zhì)低分子量標準均購自TaKaRa公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒及DNA膠回收純化試劑盒購自美國Axygen公司,His·Tag融合蛋白純化試劑盒購自QIAGEN公司,HRP標記的山羊抗大鼠二抗購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲成蟲總RNA的提取 按常規(guī)方法〔12〕尾蚴感染新西蘭大白兔,45d后剖殺,收集成蟲,抽提總RNA并測定其濃度、純度。置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 Sj TβRII樣基因cDNA全長序列由英濰捷基生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)應用RACE方法獲得。根據(jù)所獲得的序列,設計擴增其全長的特異性引物,引物 1:GTCGAGCTCATGGAATGCTAT TGTACACC,含 Sac I酶切位點,引物2:GCCAAGCT TTGATCACTGAAAGTTAGGTA,含 Hind III酶切位點。擴增SjTβRII樣基因胞外段的引物:上游引物同引物1,引物3:CGGAAGCT TGAT TAT TGGAGCTGT TATTA ,含Hind III酶切位點,以上引物均由Invitrogen公司合成。

1.2.3 Sj TβRII樣基因的 RT-PCR擴增、TA克隆及序列測定 將日本血吸蟲成蟲RNA逆轉(zhuǎn)錄,以此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板,用擴增其全長的特異性引物進行PCR:94℃預變性5 min后,熱循環(huán)參數(shù)為94℃45 s,61℃45 s,72℃2 min,共30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。純化后的PCR產(chǎn)物按pMD19-T Vector試劑盒說明書,克隆入載體pMD19-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,挑取陽性克隆,進行PCR、雙酶切和測序鑒定。通過在線 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫,跨膜結(jié)構(gòu)分析工具TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)、TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)、SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)對所獲得的cDNA序列及其氨基酸序列進行綜合分析。

1.2.4 Sj TβRII樣基因胞外段(Sj TβRII-like-N)的原核表達、蛋白純化 以成功構(gòu)建的SjTβRII樣基因的 TA克隆質(zhì)粒為模板,以引物1、3行PCR,定向克隆入pET28a(+),對篩選的克隆進行PCR、雙酶切和測序鑒定。陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導5h后收集菌液,按常規(guī)方法行SDS-PAGE電泳分析〔13〕。

按上述方法對重組菌進行大量誘導表達,收集包涵體沉淀,用8 mol/L的尿素溶解變性后,離心收集上清。將上清過Ni離子親和層析柱,用含1 mol/L咪唑的洗脫液洗脫并收集。純化的蛋白透析之后取少量樣品進行SDS-PAGE分析,并測定濃度。

1.2.5 SjTβRII樣基因胞外段蛋白多克隆抗體的制備及其效價的測定 按常規(guī)方法〔14〕將純化的目的蛋白免疫SD大鼠(200 μ g/只)。第1次免疫前采大鼠血并分離血清作為正常大鼠血清,末次免疫后10 d采血分離血清,以免疫前的大鼠血清作為陰性對照,ELISA法測定免疫大鼠血清抗體效價。

1.2.6 Western blotting鑒定 SjTβRII樣基因胞外段蛋白 取純化的重組蛋白,進行SDS-PAGE,電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜,用免疫Sj TβRII樣基因胞外段蛋白大鼠血清識別(按1∶2 500稀釋),同時以免疫前的正常大鼠血清(按1∶2 500稀釋)為陰性對照,以HRP標記的山羊抗大鼠IgG抗體作為第二抗體(按1∶5 000稀釋),進行Western blotting 分析〔13〕。

2 結(jié) 果

2.1 日本血吸蟲Sj TβRII樣基因的 RT-PCR擴增、TA克隆及鑒定 應用引物1、2,以成蟲總 RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴增獲得約2 300bp特異條帶,與預期分子量大小一致。將構(gòu)建的TA克隆重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定,與目的基因條帶相符,測序結(jié)果表明該序列與Invitrogen公司應用 RACE方法獲得的SjTβRII樣基因cDNA序列完全一致。此序列已獲得NCBI登錄號:FJ753578。

2.2 Sj TβRII樣基因的生物信息學分析SjTβRII樣基因cDNA 全長2283 bp,編碼760個氨基酸,蛋白的理論分子量為86.488 kDa,等電點為6.47。經(jīng)軟件分析其aa259-aa559具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性,確定aa1-aa144氨基酸位于胞外段,aa144-aa157氨基酸位于跨膜段,aa157-aa760氨基酸位于胞內(nèi)段,不含有信號肽序列。

同源性分析發(fā)現(xiàn)Sj TβRII樣基因氨基酸序列與曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni,S.m)TβRII(GenBank登錄號:AAV67030.1)、多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis,E.m)TβRII(Gen-Bank登錄號:CAQ76822.1)、紅原雞(Gallus gallus,G.g)TβRII(GenBank登錄號:NP_990759.1)、黑猩猩(Pan troglodytes,P.t)TβRII(GenBank登錄號:XP_001166647.1)、小鼠(Mus musculus,M.m)TβRII(GenBank 登錄號:AAH52629.1)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata,T.g)TβRII(GenBank登錄號:XP_002195667.1)、人(Homo sapiens,H.s)TβRII(GenBank登錄號 :AAA61164.1)、斑馬魚(Danio rerio,D.r)TβRII(GenBank 登 錄 號:AAI65315.1)的氨基酸序列一致性分別是70.7%、28.6%、18.4%、18.3%、18.1%、17.9%、17.9%、17.8%。因為尚未對所獲得的基因做功能研究,故暫命名為Sj TβRII樣基因。

應用Vector NTI軟件對9個物種 TβRII的氨基酸序列進行分子進化樹的構(gòu)建,見圖1,結(jié)果顯示日本血吸蟲SjTβRII樣基因和曼氏血吸蟲TβRII源于同一祖先,與人、鼠的進化關(guān)系最遠。

圖1 日本血吸蟲T βRII樣基因與其它物種T βRII的分子進化分析Fig.1 Phylogenetic analyses SjT β RII-like gene with T β RII from other species

2.3 SjTβRII樣基因胞外段克隆及蛋白表達、純化將構(gòu)建的原核表達重組質(zhì)粒分別經(jīng)PCR、雙酶切鑒定,均出現(xiàn)與目的基因相符的條帶,同時測序結(jié)果亦表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的工程菌經(jīng)IPTG誘導表達后,12%SDS-PAGE顯示分子量約在22 kDa處出現(xiàn)一明顯蛋白條帶,而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌在誘導前后以及重組質(zhì)粒工程菌在誘導前均無此蛋白條帶的出現(xiàn),表明此蛋白條帶為目的蛋白條帶,見圖2。菌體裂解上清中未見該蛋白條帶的出現(xiàn),提示該蛋白主要以包涵體形式表達。經(jīng)8 mol/L尿素變性溶解后,將溶解上清經(jīng)過Ni離子親和層析柱,在不同低濃度咪唑梯度漂洗后,用1 mol/L咪唑洗脫,獲得分子量約22kDa的較單一蛋白。

圖2 SjT βRII樣基因胞外段原核表達及純化產(chǎn)物的SDSPAGE鑒定1.未誘導的含空載體 pET28a(+)的菌體蛋白;2.誘導的含空載體pET28a(+)的菌體蛋白;3.未誘導的含重組質(zhì)粒pET28a-SjTβ RII-like-N的菌體蛋白;4.誘導的含重組質(zhì)粒的菌體蛋白;M,蛋白質(zhì)分子量標準物;5.純化后的目的蛋白Fig.2 Expression and purification of SjTβRII-like-N1,BL21 cell containing pET-28a(+)without IPTG induction;2,BL21 cell containing pET28a(+)with IPTG induction;3,BL21 cell containing pET28a-SjTβ RII-like-N without IPTG induction;4,BL21 cell containing pET28a-SjTβ RII-like-N with IPTG induction;M,protein molecular marker(masses shown on the right side);5,pET28a-SjTβRII-like-N recombinant proteins purified by the affinity purification method

2.4 Western-blotting鑒定SjTβRII樣基因胞外段重組蛋白 用ELISA方法測定免疫SjTβRII樣基因胞外段重組蛋白大鼠血清效價約為1∶10 000。免疫重組蛋白的大鼠血清對純化蛋白的 Western Blotting顯示出清晰的條帶,陰性對照未見條帶(圖3)。

3 討 論

大量實驗已證實 TβRI和TβRII在 TGF-β信號轉(zhuǎn)導中起主導作用。在抗 TGF-β的生長抑制作用的MvlLu突變細胞系研究發(fā)現(xiàn),沒有 TβRII,TβRI不能結(jié)合 TGF-β;沒有 TβRI時 ,TβRII則不能傳遞TGF-β的信號〔9-10〕。日本血吸蟲對宿主的致病主要是其引起的肝臟蟲卵肉芽腫及其纖維化病變,而 TGF-β1是目前公認的最強的肝纖維化促進因子之一〔15〕,因此獲得 SjTβRII基因序列是研究蟲體TβR所介導的TGF-β的信號傳導通路在日本血吸蟲致病方面的基礎。另外,鑒于曼氏血吸蟲的TβRII可誘導抱雌溝蛋白GCP表達,從而在雄蟲促雌蟲發(fā)育成熟方面所起的重要作用〔11〕,提示TβRII可作為疫苗候選分子。

圖3 SjTβRII樣基因胞外段純化產(chǎn)物被該蛋白免疫的大鼠血清識別M:蛋白質(zhì)分子量標準物;1:免疫大鼠血清;2:免疫前大鼠血清Fig.3 Purification of pET28a-SjT βRII-like-N recognized by antisera of SD ratM:protein mark;1:the purified product of pET28a-SjTβRII-like N reacted with immune serum of SD rat;2:the purified product of pET28a-SjTβ RII-like-N reacted with normal serum of SD rat.

通過RACE方法,本文首次獲得了日本血吸蟲TβRII樣基因全長cDNA序列,通過生物信息學分析,其 cDNA 全長2 283bp,編碼 760個氨基酸,具有TβRII保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點。序列比對發(fā)現(xiàn)其與曼氏血吸蟲TβRII氨基酸序列高度同源,而與宿主小鼠、人的TβRII氨基酸等同源性低,尤其是胞外段氨基酸序列,與小鼠和人的相應序列一致性僅為8.5%,因此,本實驗克隆、原核表達日本血吸蟲TβRII樣基因胞外段,以進一步研究其是否可作為日本血吸蟲疫苗的靶分子。

本文成功構(gòu)建了日本血吸蟲的TβRII樣基因胞外段原核表達載體,并獲得了高效表達,但表達產(chǎn)物以包涵體的形式存在,經(jīng)變性處理后的親和層析純化,可得到較純的重組蛋白。免疫大鼠可獲得高效價的免疫血清,Western blotting結(jié)果表明該蛋白具有較強的線性表位,上述實驗結(jié)果為研究Sj TβRII樣基因的生物學功能奠定了基礎。

〔1〕M assague J.T he TGF-beta family of growth and differentiation factors〔J〕.Cell,1987,49(4):437-438.

〔2〕Massague J.The transforming growth factor-beta family〔J〕.Annu Rev Cell Biol,1990,6:597-641.

〔3〕Massague J.T GF-beta signal transduction〔J〕.Annu Rev Biochem,1998,67:753-791.

〔4〕Roberts AB,Sporn M B.Differential expression of the TGF-beta isoforms in embryogenesis suggests specific roles in developing and adult tissues〔J〕.M ol Reprod Dev,1992,32(2):91-98.

〔5〕Sporn MB,Roberts AB,Wakefield LM,et al.Some recent advances in the chemistry and biology of transforming growth factor-beta〔J〕.J Cell Biol,1987,105(3):1039-1045.

〔6〕Wahl SM.T ransforming growth factor beta(TGF-beta)in inflammation:A cause and a cure〔J〕.J Clin Immunol,1992,12(2):61-74.

〔7〕Wahl SM,Chen W.Transforming g rowth factor-beta-induced regulatory T cells referee inflammato ry and autoimmune diseases〔J〕.Arthritis Res Ther,2005,7:62-68.

〔8〕Schiller M,Javelaud D,Mauviel A.TGF-beta-induced SMAD signaling and gene regulation:Consequences for extracellular matrix remodeling and wound healing〔J〕.J Dermatol Sci,2004,35(2):83-92.

〔9〕Wrana JL,Attisano L,Wieser R,et al.Mechanism of activation of the TGF-beta receptor〔J〕.Nature,1994,370:341-347.

〔10〕Willis SA,Zimmerman CM,Li LI,et al.Formation and activation by phospho rylation of activin receptor complexes〔J〕.M ol Endocrinol,1996,10(4):367-379.

〔11〕Osman A,Niles EG,Verjovski-Almeida S,et al.Schistosoma mansoni TGF-β receptor II:Role in host ligand-induced regulation of a schistosome target gene〔J〕.PLoS Pathog,2006,2(6):0536-0550.

〔12〕麥璟瑩,朱郇憫,馬長玲,等.重組日本血吸蟲FKBP12基因的酶活性及其轉(zhuǎn)錄水平鑒定〔J〕.熱帶醫(yī)學雜志,2008,8(6):529-532.

〔13〕Sambrook J,Frit sch EF,Maniatis T.M olecular cloning:A laboratory Manual〔M〕.2nded.New Yo rk:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:888-897.

〔14〕朱立平,陳學清.免疫學常用實驗方法〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社,2000:342-368.

〔15〕Branton MH,Kopp JB.TGF-beta and fibrosis〔J〕.Microbes Infect,1999,1(15):1349-1365.