補(bǔ)骨脂及雙氫青蒿素殺滅隱孢子蟲的觀察

車 頔,應(yīng) 超,李秀英,金小翠,秦元華,崔 昱

隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)主要寄生于小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣納蟲空泡內(nèi),可導(dǎo)致人體嚴(yán)重腹瀉,對(duì)人類的身體健康造成嚴(yán)重的危害。目前對(duì)隱孢子蟲病尚無(wú)特效抗蟲藥,但鑒于隱孢子蟲病發(fā)病特點(diǎn)與免疫功能密切相關(guān),因此,治療中應(yīng)兼顧提高免疫力與抑殺蟲體。本實(shí)驗(yàn)選用補(bǔ)骨脂與雙氫青蒿素二者配伍治療隱孢子蟲病鼠,期望為隱孢子蟲病免疫及中藥防治提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重28～32g(購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。連續(xù)3d糞檢均無(wú)隱孢子蟲卵囊排出。

1.2 主要試劑與儀器地塞米松磷酸鈉注射液(批號(hào):0705121,5mg/mL,泗水希爾康制藥有限公司),補(bǔ)骨脂(市售中草藥,自制水煎劑,20g/100mL),雙氫青蒿素粉劑(陜西森弗生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

掃描電鏡(JSM-6360LV,日本),透射電鏡(JEM-2000EX,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 60只小鼠隨機(jī)分成5組(每組12只,雌雄各半,雌雄分開):A組為正常對(duì)照組;B組為模型組;C組為補(bǔ)骨脂治療組;D組為雙氫青蒿素治療組;E組為補(bǔ)骨脂與雙氫青蒿素合劑治療組,并按治療1～ 2w 時(shí)間分成 A1、A2;B1、B2;C1、C2;D1、D2;E1、E2共計(jì) 10組。除 A 組外,其余各組小鼠每w2次經(jīng)腹股溝皮下注射0.05mL地塞米松磷酸鈉注射液(濃度5mg/mL),同時(shí)采用改良抗酸染色法觀察小鼠糞便中是否出現(xiàn)隱孢子蟲卵囊。4w后,各組小鼠糞便中均有卵囊出現(xiàn)。停止地塞米松磷酸鈉注射,開始進(jìn)行中藥治療。

A組每d灌服1次蒸餾水(0.5mL/只),藥物治療組C、D、E分別灌胃給藥(自制補(bǔ)骨脂藥劑的濃度為20%(3.4g/kg);雙氫青蒿素劑量 60mg/kg;合劑組為補(bǔ)骨脂與雙氫青蒿素劑量各半,灌胃前混合,每d 1次。

每d觀察小鼠的一般狀態(tài),包括毛色、攝食、活動(dòng)、體重等。1w后每組隨機(jī)取出3只雌性和3只雄性小鼠,將小鼠斷頸處死,取十二指腸與空腸交界處約1cm的小腸組織進(jìn)行病理學(xué)以及超微結(jié)構(gòu)的觀察。中藥治療2w后,重復(fù)上述方法留取待測(cè)標(biāo)本。

1.4 光鏡樣品的制備及觀察 將留取的小腸標(biāo)本置于中性福爾馬林固定12h后將樣品修塊、石蠟包埋、HE染色,鏡檢、記錄和顯微照相。

1.5 掃描電鏡樣品的制備觀察 根據(jù)石蠟切片結(jié)果取舍電鏡樣品,十二指腸與空腸的角交界處腸組織1cm,循長(zhǎng)軸剖開,置PBS漂凈腸內(nèi)容物后。在觀察前,再用新手術(shù)刀片修塊,修成2～3mm大小的組織塊,然后用 30%、50%、70%、80%、90%乙醇、2份無(wú)水乙醇以及醋酸異戊酯在微波爐中逐漸脫水1min;再進(jìn)行CO2干燥,粘塊,噴金,最后在JSM-6360LV型掃描電鏡下觀察,拍照。

1.6 透射電鏡樣品的制備及觀察 將小鼠斷頸處死,立即置于冰袋上,取盲腸以上約2cm處新鮮的回腸組織,修成1～2mm3大小的組織塊,立即置于2.5%的戊二醛中,預(yù)固定2h,OsO4后固定2h,梯度乙醇及丙酮脫水,EPON812環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,乙酸鈾-檸檬酸鉛雙染色,在透射電鏡(JEM-2000EX)下觀察,拍照。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般狀況觀察以及排卵囊規(guī)律 正常對(duì)照組:精神狀態(tài)和食欲良好,運(yùn)動(dòng)活躍,毛發(fā)順滑而有光澤。陽(yáng)性對(duì)照組:精神萎靡,活動(dòng)減少,毛色晦暗,體重下降,出現(xiàn)腹瀉,甚至死亡。藥物治療組:活動(dòng)日趨頻繁,食欲及體重增加,狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。

經(jīng)過(guò)1W和2W的治療,所有藥物治療組小鼠的糞便卵囊量與陽(yáng)性對(duì)照組相比,均明顯減少(P＜0.05),而且合劑治療組明顯低于單劑治療組(P＜0.05)。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),藥物治療組C2、D2的排卵囊量分別低于C1、D1(P＜0.05)。雙氫青蒿素治療組D1、D2排卵囊量分別明顯低于補(bǔ)骨脂治療組C1、C2(P＜0.05)。見圖 1、表1。

表1 隱孢子蟲病鼠糞檢卵囊的變化Table 1 The number of oocysts in feces in mice infected with Cryptosporidium parvum

2.2 組織學(xué)觀察

2.2.1 病理組織學(xué)觀察 1w治療組,A1組小腸絨毛整齊規(guī)則,上皮細(xì)胞及腺體結(jié)構(gòu)清晰;B1組小腸上皮有缺損樣改變,結(jié)構(gòu)不完整,可見大量炎性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);C1組小腸黏膜組織仍可見少量壞死灶,腺體排列較整齊,回腸充血,固有層有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);D1組小腸黏膜組織修復(fù)中,出現(xiàn)的壞死區(qū)域變小或減少;E1組小腸黏膜上皮及腺體結(jié)構(gòu)逐漸完整,壞死灶少見。

2w治療中,A2組小腸絨毛結(jié)構(gòu)正常,上皮細(xì)胞完好;B2組上皮細(xì)胞缺損,細(xì)胞排列不整,空腸部分腸黏膜已脫落呈火山口狀;C2組黏膜組織壞死恢復(fù),壞死灶少見;D2組黏膜恢復(fù)較好,腺體及上皮排列整齊;E2組小腸絨毛結(jié)構(gòu)及腺體完好,恢復(fù)較好。

2.2.2 掃描電鏡觀察 正常對(duì)照組:A1和A2組均可見微絨毛完整,排列整齊、緊密,無(wú)脫落現(xiàn)象。

陽(yáng)性對(duì)照組:B1組可見隱孢子蟲滋養(yǎng)體似圖釘樣深嵌于微絨毛叢內(nèi),蟲體大小不一。微絨毛較為完整,無(wú)倒伏,萎縮和脫落現(xiàn)象;B2組可見小腸上皮細(xì)胞寄生有大量的蟲體,球形或橢球形,呈現(xiàn)出微絨毛脫落、倒伏,排列紊亂現(xiàn)象,蟲體周圍微絨毛叢稀疏,有些甚至找不到微絨毛。上皮細(xì)胞大量增殖壞死。

治療組:補(bǔ)骨脂治療C1組可見小腸微絨毛完整,無(wú)倒伏,但仍有少量蟲體寄生于完整的微絨毛從中;C2組中寄生的蟲體大小不等,數(shù)量很少,微絨毛無(wú)脫落現(xiàn)象。雙氫青蒿素治療組D1可見寄生蟲體極少,所見蟲體大小均勻一致,蟲體周圍的微絨毛完整,排列整齊;D2組沒發(fā)現(xiàn)蟲體,微絨毛排列整齊。合劑治療組E1可見微絨毛整齊,偶見1蟲體,形態(tài)不規(guī)則;E2組沒找到蟲體,微絨毛完整。見圖2。

2.2.3 透射電鏡觀察 正常對(duì)照組:A1和A2組均可見小腸絨毛上皮細(xì)胞形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)完整,大小一致。細(xì)胞邊緣清晰整齊,細(xì)胞連接緊密。表面有大量的微絨毛,排列整齊,分布均勻。

陽(yáng)性對(duì)照組:B1組可見上皮細(xì)胞遭到破壞,形狀不規(guī)則,細(xì)胞連接不整齊,可見細(xì)胞腫脹,有些細(xì)胞呈短柱狀。細(xì)胞排列不整,杯狀細(xì)胞減少;B2組上皮細(xì)胞腫脹、微絨毛稀疏、倒伏,并出現(xiàn)斷裂和脫落嚴(yán)重等病征?？梢娦∈箅[孢子中期滋養(yǎng)體嵌于腸上皮細(xì)胞的刷狀緣,細(xì)胞膜下,細(xì)胞質(zhì)外。

治療組:與模型組B1相比,3個(gè)治療組C1、D1、E1的小鼠小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)均未見微絨毛倒伏,斷裂,脫落;與 B2相比,治療組 C2、D2、E2 小腸上皮細(xì)胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn),細(xì)胞排列趨于整齊。細(xì)胞連接復(fù)合體正常,細(xì)胞連接未見松散,見圖3。

圖1 隱孢子蟲卵囊(CP)(糞便,改良抗酸染色 ×1 000)Fig1 C.parvum oocysts(feces,modified acid fast stain ×1 000)

圖2 各組掃描電鏡結(jié)果Fig.2 Result of scanning electron microscope

4 討 論

中藥補(bǔ)骨脂是豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí),性溫,味辛,具有溫腎助陽(yáng)、納氣、止瀉等功效〔1〕,是臨床常用藥。崔昱等〔2-3〕用補(bǔ)骨脂與鴉膽子合劑治療大鼠卡氏肺孢子蟲肺炎,結(jié)果表明補(bǔ)骨脂可明顯提高宿主免疫力,有較強(qiáng)的抵抗氧自由基作用。很多科學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了補(bǔ)骨脂可提高小鼠特異性體液免疫以及機(jī)體非特異性免疫力及應(yīng)激態(tài)小鼠體液免疫〔4-5〕。青蒿素為菊科黃花蒿植物的提取物,能殺滅瘧原蟲,治療瘧疾,還可治療弓形蟲病、血吸蟲病、卡氏肺孢子蟲肺炎等〔6-9〕。雙氫青蒿素(Dihydroarteannuin,DHA)為青蒿素類在體內(nèi)最終的有效形式,也有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用〔10〕,有學(xué)者實(shí)驗(yàn)證實(shí)DHA可通過(guò)作用于陰道毛滴蟲微絲結(jié)構(gòu),破壞其結(jié)構(gòu)和功能,達(dá)到抑殺蟲,清除感染的目的〔11〕;DHA還可對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的質(zhì)膜及細(xì)胞骨架產(chǎn)生較強(qiáng)的損傷作用,達(dá)到抑殺蟲體的目的〔12〕;而隱孢子蟲的細(xì)胞骨架蛋白在蟲體的運(yùn)動(dòng)和侵入宿主的過(guò)程中發(fā)揮重要作用〔13〕。因此,我們可利用DHA藥學(xué)機(jī)制來(lái)控制隱孢子蟲的感染及防止疾病的發(fā)生。

圖3 各組透射電鏡結(jié)果Fig.3 Result of transmission electron microscope

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)對(duì)隱孢子蟲感染小鼠中藥治療前后體質(zhì)變化、卵囊排出量以及腸壁黏膜組織病理及超微結(jié)構(gòu)變化動(dòng)態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)中藥補(bǔ)骨脂、雙氫青蒿素以及二者合劑組對(duì)隱孢子蟲病的治療效果是令人滿意的。在抑殺蟲效果方面,合劑治療組優(yōu)于單劑治療組;雙氫青蒿素組優(yōu)于補(bǔ)骨脂組;2w組優(yōu)于1w組,表明較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定持續(xù)治療明顯有助感染控制及免疫應(yīng)答反應(yīng)能力的提高。陽(yáng)性對(duì)照組的小腸,在15 000,20 000倍掃描電鏡下觀察,可見上皮細(xì)胞有大量蟲體寄生,呈球形或橢球形的蟲體似圖釘樣寄居于微絨毛叢中,大量蟲體覆蓋于小腸微絨毛上皮的表面,溶噬腸壁黏膜,致使微絨毛倒伏、脫落,嚴(yán)重影響其營(yíng)養(yǎng)的吸收。而與相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照組相比,所有治療小鼠黏膜上皮細(xì)胞處于修復(fù)之中,上皮細(xì)胞的細(xì)胞連接趨于整齊,微絨毛趨于直立及完整。盡管在1w治療組中尚存少量還沒有完全修復(fù)的病灶,并且在這些病灶中發(fā)現(xiàn)個(gè)別殘存的滋養(yǎng)體,其周圍的微絨毛已開始修復(fù)緊密、整齊,較少有倒伏、腫脹和脫落的現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)2周后各治療組小鼠幾乎找不到隱孢子蟲的寄生,由此可見這兩種中藥對(duì)隱孢子蟲的感染和治療有較為明顯的療效,而且二者具有協(xié)同抑殺蟲體、提高機(jī)體免疫力,以抵御隱孢子蟲感染與致病的作用。

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