IL-15對人γδT細(xì)胞殺傷結(jié)核桿菌感染THP-1細(xì)胞的影響＊

金齊力,韋 莉,姜麗娜,姚春艷李柏青

IL-15對人γδT細(xì)胞殺傷結(jié)核桿菌感染THP-1細(xì)胞的影響＊

金齊力1,2,,韋 莉2,3,姜麗娜2,4,姚春艷1,2,李柏青1,2

目的 建立結(jié)核桿菌(M tb)感染單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞系模型;用流式細(xì)胞術(shù)檢測人γδT細(xì)胞對M tb感染THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性;并觀察IL-15對人γδT細(xì)胞殺傷 M tb感染 THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的影響。方法M tb以10∶1的比例感染佛波醇酯(PMA)分化的THP-1細(xì)胞,建立M tb感染細(xì)胞模型。人外周血單個核細(xì)胞用M tb耐熱性低分子多肽類抗原刺激優(yōu)勢擴(kuò)增γδT細(xì)胞,作為效應(yīng)細(xì)胞用于細(xì)胞毒活性實驗。用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記 M tb感染THP-1細(xì)胞,作為靶細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞以不同比例孵育4 h,用碘化丙啶(PI)染色后在流式細(xì)胞儀上檢測,CSFE和PI雙陽性細(xì)胞為被殺傷靶細(xì)胞。IL-15作用于γδT細(xì)胞24 h后,再檢測γδT細(xì)胞對 M tb感染 THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。結(jié)果

人γδT細(xì)胞與 M tb感染 THP-1細(xì)胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后,人γδT細(xì)胞對結(jié)核桿菌感染的 THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性從22.5%增加至80.7%;而γδT細(xì)胞與未感染 M tb的 THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性為16.1%至47.2%。IL-15作用γδT細(xì)胞后的細(xì)胞毒活性(64.06%)與對照組(46.81%)相比明顯增加(P<0.05)。結(jié)論人γδT細(xì)胞對 M tb感染 THP-1細(xì)胞的殺傷活性明顯高于對未感染M tb的THP-1細(xì)胞的作用,殺傷活性隨效靶比的增加而增加。IL-15可以增強(qiáng)人γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

IL-15;結(jié)核桿菌;γδT細(xì)胞;THP-1細(xì)胞;細(xì)胞毒活性

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis,M tb)感染引起的一種慢性傳染病,結(jié)核分枝桿菌亦簡稱結(jié)核桿菌,其入侵的宿主細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞,并在一定的條件下可在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活以及增殖。但活化的巨噬細(xì)胞也可銷毀吞噬的M tb,并將其降解成多肽后將抗原信息傳遞給 T細(xì)胞,引起特異性的免疫反應(yīng)。以往的研究表明,M tb感染宿主后可誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答,并激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng),在抗M tb感染中發(fā)揮主導(dǎo)作用〔1〕。近年來的研究證明,γδT細(xì)胞在抗感染免疫,特別是在抗 M tb感染免疫中同樣發(fā)揮重要作用〔2〕。

γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞細(xì)胞毒活性在研究γδT細(xì)胞的抗結(jié)核免疫中有重要的意義。本研究建立CFSE/PI雙標(biāo)記的流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)檢測人γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,為深入闡明γδT細(xì)胞殺傷 M tb感染巨噬細(xì)胞的機(jī)理打下基礎(chǔ)。近年來,IL-15在胞內(nèi)菌感染的免疫應(yīng)答中的作用得到越來越多的重視。有研究表明IL-15可通過增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答發(fā)揮抗M tb作用〔3〕,本實驗則觀察了 IL-15作用后γδT 細(xì)胞對M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,以探討 IL-15對γδT細(xì)胞抗M tb感染免疫作用的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞株 結(jié)核分枝桿菌 H37Ra株:購于中國生物制品檢定所北京菌種保藏中心,批號:9302025;人單核細(xì)胞系 THP-1細(xì)胞購自美國A-merican Type Culture Collection公司,用含10%小牛血清的RPM I-1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器 異硫氰酸熒光素(fluorescein is othiocyanate,FITC)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DM SO)購自 M erck公司;培養(yǎng)基 RPM I1640,GIBCO公司產(chǎn)品;新生牛血清(NBS)購于杭州四季青生物公司;淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypaque),天津 TBD生物技術(shù)發(fā)展中心產(chǎn)品;重組人白細(xì)胞介素2(rh IL-2),長春長生基因藥業(yè)公司產(chǎn)品;重組人白細(xì)胞介素15(rh IL-15),Pep ro Tech公司產(chǎn)品;二乙酸熒光素(Fluorescein diacetate,FDA)和CFSE購自 Invitrogen;PMA和 PI購自 Sigma公司;抗人CD3-FITC,天津協(xié)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;抗人 TCRγδ-PE,BD公司產(chǎn)品;流式細(xì)胞儀FACSCalibur為美國BD公司產(chǎn)品;超聲細(xì)胞粉碎機(jī)JY-Ⅱ型為寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡(日本Nikon)。

1.3 M tb菌懸液的制備 見參考文獻(xiàn)〔5〕。

1.4 建立M tb感染PMA分化的 THP-1細(xì)胞模型

將凍存的 THP-1細(xì)胞復(fù)蘇后,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),收獲指數(shù)生長期細(xì)胞,以1×106/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中、每孔2 m L細(xì)胞懸液,加入PMA,終濃度為40 ng/m L,24 h后細(xì)胞發(fā)生巨噬細(xì)胞樣變化(貼壁生長,形態(tài)不規(guī)則,有偽足伸出),此時的THP-1細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞。吸去培養(yǎng)液,加入預(yù)溫的完全培養(yǎng)液輕輕吹去未貼壁及貼壁不緊的細(xì)胞,以10∶1的比例加入 M tb或M tb-FITC懸液,37℃,5%CO2孵育箱孵育過夜,抗酸染色觀察巨噬細(xì)胞對M tb吞噬活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞的吞噬率。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞對M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性

1.5.1靶細(xì)胞的標(biāo)記 收集靶細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和M tb感染后的巨噬細(xì)胞),調(diào)整靶細(xì)胞濃度為1×106/m L,用終濃度為 0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞,37℃,5%CO2孵箱內(nèi)放置10 m in。用完全培養(yǎng)基洗3次去除殘余的染料,并懸浮于完全培養(yǎng)基中;37℃、5%CO2孵箱內(nèi)放置4 h后,上流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.2 效應(yīng)細(xì)胞的準(zhǔn)備 常規(guī)方法獲取健康成人外周血單個核細(xì)胞(PBMC),用含50 m l/L NBS 50 m l/L人自體血清的RPM I1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為(1-2)×106/m L,植入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔1mL。加入 M tb.Ag(終濃度5μg/m L)和rh IL-2(終濃度50 U/m L),用于誘導(dǎo)和擴(kuò)增γδT細(xì)胞。當(dāng)M tb.Ag活化的 T細(xì)胞生長到第10天時,流式細(xì)胞儀檢測γδT細(xì)胞的百分率,γδT細(xì)胞的百分率>85%的用于γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性實驗。

1.5.3 效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞活力的測定 調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞濃度為1×106/m L,取100μL細(xì)胞懸液,加入FDA溶液,使其終濃度為50 ng/m L,混勻,室溫下作用5 min,流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,FDA陽性細(xì)胞為活細(xì)胞,CELLQuest或W inMD I 2.8軟件分析。用于實驗的細(xì)胞活力>90%。

1.5.4 細(xì)胞毒試驗 效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞混合放入U型96孔板中,反應(yīng)體系為200μL。設(shè)置3個平行復(fù)孔,每孔加入8 000個靶細(xì)胞,效靶比(效應(yīng)細(xì)胞∶靶細(xì)胞,E∶T)分別為50∶1,20∶1,10∶1,5∶1及1∶1。120 g離心2 min。37℃,5%CO2孵育4 h。吸出細(xì)胞懸液加入流式管,PBS洗3次。加入4μL PI(100μg/m L),置冰上5 min后 ,60 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析,用 CellQuest或 WinMD I 2.8軟件獲取和分析數(shù)據(jù)。FL1熒光通道檢測CFSE的熒光強(qiáng)度,FL 3熒光通道檢測 PI的熒光強(qiáng)度。先以CFSE陽性標(biāo)記的靶細(xì)胞設(shè)門為 R1,收集2000個靶細(xì)胞。在PI和CFSE雙標(biāo)記的散點(diǎn)圖中,進(jìn)一步分析R1門中的靶細(xì)胞,其中 PI和CFSE雙標(biāo)記的細(xì)胞為死亡的靶細(xì)胞。

1.5.5 IL-15對γδT細(xì)胞殺傷 M tb感染巨噬細(xì)胞的作用 收集培養(yǎng)的γδT細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL,24孔板中每孔加入1 m L細(xì)胞懸液,再加入rh IL-15,終濃度為20 U/m L,作用24 h后收集γδT細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的作用比例為10∶1,流式細(xì)胞儀檢測 IL-15作用后γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。

2 結(jié) 果

2.1 感染模型的建立 M tb與 THP-1細(xì)胞或PMA分化的 THP-1細(xì)胞共孵育過夜后,流式細(xì)胞儀檢測PM A分化的 THP-1細(xì)胞對 M tb的吞噬率達(dá)90%以上,見圖1?？顾崛旧@微鏡觀察的結(jié)果顯示,感染后90%以上的PM A分化的 THP-1細(xì)胞內(nèi)有3-5個以上的 M tb;而未分化的 THP-1細(xì)胞的吞噬率在小于10%,感染后僅有少數(shù) THP-1細(xì)胞內(nèi)有少量的 M tb。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測THP-1細(xì)胞在分化前后對 M tb的吞噬率A:未分化的 THP-1細(xì)胞對 M tb的吞噬率B:PMA分化后的 THP-1細(xì)胞對M tb的吞噬率Fig.1 Phagocytosis rate of THP-1 cells and PM A differentiated THP-1 cells detected by FACS A:Phagocytosis rate of THP-1 cells to Mtb B:Phagocytosis rate of PMA differentiated THP-1 cells to M tb

2.2 不同濃度CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞 靶細(xì)胞濃度一定時,以不同濃度的CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞,標(biāo)記4 h后上流式細(xì)胞儀檢測,流式分析結(jié)果見圖3。CFSE濃度在2μmol/L時,CFSE陽性細(xì)胞的峰值在102處,CFSE濃度在4μmol/L時,CFSE陽性細(xì)胞的峰值在102-103處,CFSE濃度在8μmol/L時,CFSE陽性細(xì)胞的峰值在103處,可以與效應(yīng)細(xì)胞分開,此時的CFSE濃度為實驗用濃度。

圖2 不同濃度CFSE標(biāo)記的靶細(xì)胞Fig.2 CFSE labeled target cellsat different concentrations

2.3 效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞存活率的檢測 PBMC經(jīng)M tb.Ag誘導(dǎo)和擴(kuò)增后,γδT細(xì)胞比例增加,當(dāng)培養(yǎng)到第10d左右,流式細(xì)胞儀檢測γδT細(xì)胞比例,選擇人γδT細(xì)胞比例達(dá)85%以上的用于細(xì)胞毒活性檢測,實驗前檢測細(xì)胞存活率達(dá)90%以上。THP-1細(xì)胞和PM A分化后的 THP-1細(xì)胞的存活率也可達(dá)90%以上,如圖3所示。

2.4 人γδT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞和 M tb感染后巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性 從圖5可以看出人γδT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞和M tb感染后巨噬細(xì)胞均有細(xì)胞毒活性,且人γδT細(xì)胞對兩者的殺傷活性均隨效靶比的增加而增加;在效靶比相同的條件下人γδT細(xì)胞對M tb感染后巨噬細(xì)胞的殺傷活性高于對未感染巨噬細(xì)胞的殺傷活性。不加效應(yīng)細(xì)胞組,M tb感染后的巨噬細(xì)胞發(fā)生部分凋亡,其自然死亡率高于未用M tb感染的巨噬細(xì)胞。

2.5 IL-15對人γδT細(xì)胞殺傷 M tb感染 PM A分化 THP-1細(xì)胞的影響 IL-15刺激人γδT細(xì)胞后,效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞以10∶1的比例作用,人γδT細(xì)胞對M tb感染后的PMA分化 THP-1細(xì)胞的殺傷活性為(64.06±4.07)%,IL-15刺激前人γδT細(xì)胞對M tb感染后的 PMA分化 THP-1細(xì)胞的殺傷活性為(46.81±2.04)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

THP-1細(xì)胞來源于人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞,其細(xì)胞表型和分化更能完整的代表實驗中人單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能趨勢,ST細(xì)胞比動物細(xì)胞能更真實地反映人類實驗?zāi)Ｊ?因此是目前運(yùn)用較多的用以研究單核巨噬細(xì)胞分化及功能的細(xì)胞模型。THP-1細(xì)胞在 PMA分化前后對 M tb的吞噬能力有很大差異。THP-1細(xì)胞對 M tb的吞噬能力較低;PMA分化后的 THP-1細(xì)胞變得具粘附、貼壁、特性形態(tài)不規(guī)則,此時的THP-1細(xì)胞可認(rèn)為是巨噬細(xì)胞,對M tb的吞噬能力變強(qiáng)。我們用流式細(xì)胞術(shù)以及抗酸染色后顯微鏡檢的方法 M tb感染巨噬細(xì)胞的模型加以驗證,兩種方法檢測的結(jié)果一致,但用流式細(xì)胞術(shù)檢測單核巨噬細(xì)胞對 M tb的吞噬作用,方法簡便、快速、客觀、重復(fù)性好。

圖3 γδT細(xì)胞與靶細(xì)胞活力檢測A:M tb A T中γδT細(xì)胞百分率;B:γδT細(xì)胞的活力;C:M tb感染的巨噬細(xì)胞的活力;D:未感染巨噬細(xì)胞的活力Fig.3 The vitality of gammadelta T cellsand target cells A:The percentage of gammadelta t cells in M tb A T;B:The viability of gammadelta T cells;C:The viability of M tb infected macrophages;D:The viability of uninfected macrophages

本實驗用經(jīng) PMA誘導(dǎo)分化后的 THP-1細(xì)胞作為 Mtb感染對象,建立和完善了體外研究 M tb與巨噬細(xì)胞相互作用的模型。用CFSE/PI雙標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。傳統(tǒng)檢測γδT細(xì)胞細(xì)胞毒活性的方法是51Cr釋放實驗,雖然這種方法重復(fù)性好,操作簡單,但它仍有幾個缺點(diǎn),如標(biāo)記的細(xì)胞51Cr自發(fā)釋放率高;細(xì)胞殺傷的實際情況和51Cr標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)蛋白釋放入上清液有時間延遲;在總體水平檢測細(xì)胞的裂解,而不是在單細(xì)胞水平上;需處理放射性同位素等等。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞毒的方法基于單細(xì)胞水平,克服了上述方法的缺陷,實驗原理是先用第一種熒光染料CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞,用以區(qū)分效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞。再用第二種DNA熒光染料 PI來區(qū)分細(xì)胞膜已破壞的靶細(xì)胞并計算其百分率。此方法中CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞的濃度很關(guān)健,我們通過多次實驗發(fā)現(xiàn),靶細(xì)胞濃度在1×106/m l的條件下,終濃度8μmol/L的 CFSE是較理想的標(biāo)記濃度,此時CFSE陽性靶細(xì)胞的峰值在103處,可以很好的區(qū)分效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞,且對靶細(xì)胞的活性沒有影響。

實驗顯示人γδT細(xì)胞對巨噬細(xì)胞和 M tb感染巨噬細(xì)胞均有細(xì)胞毒活性,且隨著γδT細(xì)胞與靶細(xì)胞比例的增加,人γδT細(xì)胞對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性亦增強(qiáng)。在相同效靶比的情況下,人γδT細(xì)胞對M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性強(qiáng)于對未感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,這可能與 M tb感染后巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)發(fā)生變化,人γδT細(xì)胞易于識別有關(guān)。γδT細(xì)胞表面可以表達(dá)C型凝集素家族跨膜蛋白N KG2D,可以識別 M HC-I類鏈相關(guān)分子 A(M HC class I chain-related molecules A,MCIA),M ICA應(yīng)激性表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞的表面。有研究顯示N KG2D-M ICA相互作用可以直接活化 Vγ9Vδ2細(xì)胞〔6〕,而 IL-15可以增加人γδT細(xì)胞N KG2D的表達(dá),在加強(qiáng)抗 M tb感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮一定的作用〔7〕。我們在實驗中發(fā)現(xiàn) IL-15刺激后的人γδT細(xì)胞對 M tb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性增強(qiáng)?，F(xiàn)有研究證明人γδT可以通過顆粒酶和穿孔素途徑殺傷 M tb感染巨噬細(xì)胞〔8〕,人γδT細(xì)胞是否通過N KG2D途徑殺傷結(jié)核桿菌感染巨噬細(xì)胞有待進(jìn)一步的實驗證明。

圖6 IL-15對人γδT細(xì)胞殺傷 M tb感染巨噬細(xì)胞的影響Fig.6 The influence of cytotoxicities of gdT cellsagainst M tb infected macrophages

在過去十多年的研究中,國內(nèi)外眾多學(xué)者對γδT細(xì)胞在抗結(jié)核感染中的作用作了大量的研究,使我們對γδT細(xì)胞參與結(jié)核感染時的作用機(jī)制及γδT細(xì)胞與其它細(xì)胞亞群之間的相互作用有了一定認(rèn)識,但由于γδT細(xì)胞表現(xiàn)型的多樣性和分泌細(xì)胞因子的復(fù)雜性,使得其對抗原識別的分子機(jī)理、參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、免疫耐受的確切機(jī)制等問題尚不甚明了,還有很多現(xiàn)象難以解釋,甚至出現(xiàn)了一些前后矛盾的結(jié)果。但有一點(diǎn)已經(jīng)得到廣大學(xué)者的肯定,那就是γδT細(xì)胞在結(jié)核感染免疫中能對宿主提供保護(hù)作用。在抗感染方面,國外已經(jīng)開展針對 IL-15的基因治療,而國內(nèi)這方面研究比較少,開展針對IL-15的研究可為防治胞內(nèi)病原體感染提供新的思路和策略。

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Effect of interleukin 15 on the cytotoxicity of humanγδT cellsagainst Mycobacterium tuberculosis infected THP-1 cells

JIN Qi-li,W EILi,JIANG Li-na,YAO Chun-yan,L IBai-qing

(1.Department of Imm unology,Bengbu M edical College;2.Anhui Key Laboratory of Infection and Immunity at Bengbu Medical College;3.Department of Pathogen Biology,Bengbu Medica l College;4.Department of Pathophysiology,Bengbu Medical College 233030,China)

To establish themodel of M ycobacterium tuberculosis(M tb)infected THP-1 cells,THP-1 cellswere infected by Mtbat a 10∶1 ratio for 18 h.And to establish themethod for detection of cytotoxicity of human gd T cells against M tb infected THP-1 cells,peripheral blood mononuclear cells(PBMC)from normal human subjects were stimulated with Mtb.Ag to generate M tb.Ag activated T cells(M tb.A T)that wereγδ T cellsp redominantly and as the effector cells(E).And the Mtb infected THP-1 cells labeled with CFSE as target cells(T).The effector cellsand target cells were cocultured for 4 h with different proportions,and both CFSE and PIpositive cells analyzed by flow cytometry as the killed target cells were stained with PI.While human gd T cells and THP-1 cells were cocultured for 4 h at the proportions from 1∶1 to 50∶1,the cytotoxicities of humanγδT cells increased from 16.1%to 47.2%.As humangd T cells and M tb infected THP∶1 cells were cocultured for 4 h at the proportions from 1 ∶1 to 50 ∶1,the cytotoxicities of humanγδT cells increased from 22.5%to 80.7%.It’s concluded that the cytotoxicities of humanγδT cells against Mtb infected THP∶1 cells are higher than uninfected THP-1 cells.Furthermo re,the cyto toxicities increase when E/T proportions increase and IL-15 could enhance the cytotoxicities of humanγδ T cells against M tb infected macrophages.

IL-15;M ycobacterium tuberculosis;γδ T cells;THP-1 cell;cytotoxicity

2.安徽省感染與免疫重點(diǎn)實驗室,蚌埠233030;3.蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室,蚌埠 233030;4.蚌埠醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,蚌埠 233030

R378

A

1002-2694(2010)10-0926-05

＊國家科技重大專項基金課題(2008ZX10003011),安徽省省級重點(diǎn)實驗室重點(diǎn)科研項目(2004 sys008),蚌埠醫(yī)學(xué)院院級科研項目(BY0918))

李柏青,Email:baiqingli@bbmc.edu.cn

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,蚌埠 233030;

2009-12-21;

2010-03-24