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    夏氏瘧原蟲感染早期易感和抵抗小鼠樹突狀細胞細胞因子的分泌特點*

    2010-11-13 07:29:16武靜靜潘艷艷劉力源姜懿凌曹雅明
    中國人獸共患病學報 2010年10期
    關鍵詞:瘧原蟲免疫調節(jié)瘧疾

    武靜靜,劉 軍,鄭 偉,潘艷艷,李 瑩,劉力源,姜懿凌,曹雅明,鄭 麗

    2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科,沈陽 110016;

    3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科,沈陽 110016

    瘧疾感染早期,保護性免疫應答的建立有賴于CD4+T細胞的有效活化〔1〕,不同亞群 CD4+T細胞的活化和抗原提呈細胞分泌的細胞因子密切相關。樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)產生IL-12誘導以IFN-γ分泌增加為主的Th1細胞免疫應答,對夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabaudi chabaudiAS,P.c.chabaudiAS)感染的控制和清除至關重要〔2〕。然而,過強的CD4+T細胞應答,尤其是IFN-γ參與的炎癥應答,與免疫病變的發(fā)生密切相關〔3〕。同時,有研究顯示,DCs分泌的IL-10和TGF-β明顯抑制肝階段 T細胞介導的保護性免疫應答〔4〕。因此,DCs在瘧疾感染早期可能通過分泌不同種類的細胞因子參與易感和抵抗小鼠Th1細胞免疫應答的誘導和調控。

    本研究利用成功建立的P.c.chabaudiAS感染的DBA/2和BALB/c小鼠模型,采用磁珠純化的方法分離DCs并進行體外培養(yǎng),ELISA方法檢測DCs培養(yǎng)上清中細胞因子IL-12p40、IL-10和TGF-β1的分泌水平,以期探討瘧疾感染早期DCs前炎性和免疫調節(jié)性細胞因子的分泌特點,旨在明確DCs對Th1細胞免疫應答調節(jié)的相關機制。

    1 材料與方法

    1.1 瘧原蟲及實驗動物感染 6-8w齡、雌性DBA/2和BALB/c小鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供,許可證編號:SCXK京200420001)經腹腔感染1×106P.c.chabaudiAS(日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈)寄生的紅細胞(Parasitized Red Blood Cell,pRBC),感染不同時間的小鼠經尾靜脈采血,制備薄血膜,Giemsa染色,鏡檢計數紅細胞感染率。

    1.2 脾DCs的純化和培養(yǎng) 無菌取出感染前和感染后3d、5d、8d小鼠脾臟,常規(guī)方法制備脾細胞懸液,用0.17mol/L NH4Cl裂解紅細胞。以含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640調整脾細胞終濃度為1×107/mL。按文獻〔5〕方法,從小鼠脾細胞中純化DCs,培養(yǎng)48h后收集上清,-80℃保存,待細胞因子IL-12p40 、IL-10 和 TGF-β1檢測 。

    1.3 細胞因子的檢測 用雙抗體夾心ELISA試劑盒分別檢測 DCs培養(yǎng)上清中 IL-12p40、IL-10和TGF-β1的分泌水平。酶標儀測定450nm處OD值。結果以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線,應用SoftMax Pro 4.3.1Ls軟件分析,計算細胞因子含量(pg/m1)。

    1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5統(tǒng)計學分析軟件,單因素方差分析比較各組均值的顯著性差異,P<0.05為差異顯著(結果為3次結果的均值)。

    2 結 果

    2.1 兩種小鼠感染后不同時間的蟲體血癥水平及生存率 感染后4d,兩種小鼠外周血中均出現瘧原蟲感染的紅細胞,且感染后前9d,原蟲血癥水平呈相同的上升趨勢。BALB/c小鼠原蟲血癥水平至感染后9d達峰值后迅速下降,并于感染后21d左右自愈,其生存率100%;相比而言,DBA/2小鼠的紅細胞感染率至感染后9d達峰值后也迅速下降,70%~80%的小鼠死亡,幸存小鼠不能清除感染,有低水平的蟲體血癥,見圖1。

    圖1 DBA/2與BALB/c小鼠感染后不同時間蟲體血癥水平及生存率Fig.1 The parasitemia and survival rate of DBA/2 and BALB/c mice at different time points after infection

    2.2 兩種小鼠感染后不同時間DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平 感染后3d-5d,DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平出現顯著升高(P<0.05或P<0.01),感染后第 8d達峰值(P<0.01)。相比,BALB/c小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-12p40的水平從感染后5d出現有意義的升高,8d達峰值(P<0.05),但在感染后3d-8d其水平均明顯低于DBA/2小鼠(P<0.05或P<0.01),見圖2。

    2.3 兩種小鼠感染后不同時間DCs培養(yǎng)上清中IL-10的水平 感染后第5d,兩種小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-10的分泌水平明顯升高(P<0.05或P<0.01),并于感染后第8d達到最高水平(P<0.05或P<0.01);在感染后第5d和第 8d,DBA/2小鼠DCs培養(yǎng)上清中IL-10的分泌水平均明顯低于BALB/c小鼠(P<0.05),見圖3。

    2.4 兩種小鼠感染后不同時間DCs培養(yǎng)上清中TGF-β1的水平 感染后第5d,兩種小鼠DCs培養(yǎng)上清中TGF-β1的分泌水平明顯升高(P<0.01),并于感染后第8d達到最高水平(P<0.01);在感染后第 5d和第 8d,DBA/2小鼠 DCs培養(yǎng)上清中TGF-β1的分泌水平均明顯低于BALB/c小鼠(P<0.05),見圖4。

    3 討 論

    瘧疾感染早期有效的 Th1細胞免疫應答的建立和維持對于控制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖和宿主的存活至關重要〔6-7〕,然而過度的 Th1應答也會對小鼠造成一定的病理損傷如引發(fā)肝損傷〔8〕。DCs在誘導固有和適應性免疫應答方面發(fā)揮著舉足輕重的作用,活化的DCs通過分泌不同種類的細胞因子來參與調控Th1/Th2免疫應答〔9〕。瘧疾感染過程中,DCs分泌的IL-12是啟動Thl細胞免疫應答的重要細胞因子〔2〕。本實驗結果顯示,感染后第3-8d,DBA/2小鼠與BALB/c小鼠DCs分泌的IL-12水平均呈逐漸增高趨勢,但DBA/2小鼠DCs分泌的IL-12水平顯著高于BALB/c小鼠。以上結果充分提示,P.c.chabaudiAS感染易感型DBA/2和抵抗型BALB/c小鼠之后,兩種小鼠均成功建立了Th1細胞免疫應答,并且這種初步建立的Th1免疫應答差異明顯依賴于IL-12分泌的數量。

    圖4 DBA/2和BALB/c小鼠感染后不同時間脾臟DCs培養(yǎng)上清中TGF-β 1水平;**P<0.01表示與正常對照組相比差異顯著,#P<0.05表示DBA/2與BALB/c小鼠之間的比較Fig.4 The levels of TGF-β1 in DCs supernatants from DBA/2 and BALB/c mice at different time points after infection;**:P<0.01 indicates the significant difference compared with control mice(non-infected mice,0d),#P<0.05 indicates the comparison between DBA/2 and BALB/c mice

    免疫調節(jié)性細胞因子IL-10和 TGF-β在多種細胞內病原體(包括瘧原蟲)感染過程中,主要通過免疫抑制作用參與免疫應答的調控。本實驗結果顯示,感染后3~8d,兩種小鼠DCs分泌的 IL-10和TGF-β1的水平均呈逐漸升高趨勢,感染后5-8d出現有意義升高,并且BALB/c小鼠DCs分泌的IL-10與TGF-β1水平明顯高于DBA/2小鼠。由此提示,BALB/c小鼠正是由于分泌IL-10和TGF-β1的DCs的適度活化,使其Th1細胞免疫應答能夠維持在適宜水平。DBA/2小鼠DCs不能分泌足夠的抑制性細胞因子IL-10和TGF-β1,使其Th1細胞免疫應答過強,從而導致免疫病理損傷。因此,分泌免疫調節(jié)性細胞因子IL-10和TGF-β1的DCs的活化強度和時相明顯影響著Th1細胞免疫應答的水平和效應強度。

    綜上所述,BALB/c小鼠和DBA/2小鼠在DCs細胞因子的分泌模式上存在顯著差異。而這種差異性也進一步提示,DCs分泌的前炎性細胞因子IL-12和免疫調節(jié)性細胞因子IL-10和TGF-β1之間處于動態(tài)平衡模式中,而這一平衡模式明顯決定著Th1細胞免疫應答的啟動和調控。

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