清涼膏中靛玉紅的含量測(cè)定

錢(qián) 嘉， 張興德， 夏 勤， 呂游春

腫痛型外痔是肛腸科常見(jiàn)的疾病，臨床多采用保守治療。目前所用的市售外用制劑多為馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏。清涼膏是名老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)方，由青黛、乳香、沒(méi)藥、黃連等藥組成，為南京市中醫(yī)院醫(yī)院制劑(批準(zhǔn)文號(hào)Z04000824)，應(yīng)用已20余年，臨床療效佳。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制手段過(guò)于簡(jiǎn)單，沒(méi)有規(guī)定制劑中君藥青黛中的主要成分靛玉紅的含量測(cè)定方法，制劑質(zhì)量難以保證。為有效控制制劑質(zhì)量，筆者建立高效液相色譜法測(cè)定靛玉紅含量的方法，為建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

SPD-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津公司)；HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠)；索氏提取器(東方科儀)。清涼膏(南京市中醫(yī)院醫(yī)院制劑，批號(hào)：081124)；靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：717-200204)。色譜純甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)；分析純醋酸(南京化學(xué)試劑有限公司)；重蒸水自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為AKZONOBEL Kromasil C18(250 mm×4.6 mm)。流動(dòng)相為甲醇∶0.2%醋酸(67∶33)，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為289 nm[1]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品約3.76 mg，精密稱(chēng)定后置100 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密量取2 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為7.52 μg/mL的靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱(chēng)取清涼膏制劑5 g，精密稱(chēng)定，用濾紙包裹后放入索氏提取器中，加甲醇100 mL，提取4 h后，將提取液過(guò)濾，濃縮，置容量瓶中，定容至25 mL。

2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按處方組成稱(chēng)取除青黛以外的其余藥物并按照清涼膏制備工藝制成缺青黛的陰性制劑，同供試品溶液的制備方法制備成陰性供試液。取靛玉紅對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試液各10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，結(jié)果為，峰1為靛玉紅的色譜峰，保留時(shí)間為23.028 min，在陰性供試液的色譜圖中靛玉紅相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，說(shuō)明陰性無(wú)干擾(圖1～3)。

圖1 靛玉紅對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 陰性供試液色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別稀釋至濃度為1.88 μg/mL、3.76 μ/mL、7.52 μg/mL、 11.28 μg/mL和 18.80 μg/mL的對(duì)照品溶液，分別取樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以靛玉紅的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程:y=59 989x+8 772.6(r=0.999 9)。結(jié)果表明，在1.88～18.8 μg/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為7.52 μg/mL靛玉紅對(duì)照品溶液10 μL，依法測(cè)定5次，RSD為1.61%(n=5)。結(jié)果表明，該方法精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液分別于0、2、4、8、12和24 h測(cè)定，RSD為2.60%，結(jié)果表明，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同批供試品(批號(hào)：081124)，平行5份，按供試品溶液同法制備，精密吸取10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，RSD為2.69%(n=5)。

2.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量重現(xiàn)性項(xiàng)下的樣品(批號(hào)：081124，含量：7.29 μg/g)，平行5份，分別精密加入濃度為3.76 μg/mL的靛玉紅對(duì)照品溶液0.5 mL，按2.3方法進(jìn)行處理，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.10 樣品含量測(cè)定 取三批清涼膏制劑，每批取約5 g，精密稱(chēng)定，按2.3方法處理樣品，照2.1色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，三批清涼膏制劑中靛玉紅含量為7.25 μg/g。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

以甲醇∶水=70∶30；甲醇∶水=67∶33；甲醇∶0.1%醋酸水=67∶33；甲醇∶0.2%醋酸=67∶33為流動(dòng)相分別進(jìn)行考察，結(jié)果顯示流動(dòng)相為甲醇:0.2%醋酸為67:33時(shí)，各色譜峰能完全分離且峰形良好。

制劑樣品處理常采用超聲提取法、熱回流法等常規(guī)提取方法，提取效率往往一般[2-3]。索氏提取法又稱(chēng)連續(xù)回流提取法，此法可使制劑中的有效成分連續(xù)不斷地被溶劑萃取，既節(jié)約溶利又提高萃取效率。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為軟膏劑，其基質(zhì)通常影響有效成分的提取，索氏提取法可最大程度地從基質(zhì)中提取有效成分，為適宜的提取方法。

靛玉紅可溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚、甲醇等中等極性的溶劑中。我們分別以氯仿、乙酸乙酯、甲醇為溶劑進(jìn)行樣品制備，結(jié)果三種樣品含量接近，分離效果與峰形相差亦不大，考慮到氯仿毒性較大，而乙酸乙酯試劑成本較高，故選擇甲醇作為提取溶劑。

[1] 游勇基,黃碧云.青黛中靛玉紅含量測(cè)定方法的研究[J].海峽藥學(xué),2007,19(12):38-41.

[2] 程力惠,李曉蒙.高效液相色譜法測(cè)定青黛中靛玉紅的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007,18(5):1066-1077.

[3] 張青松,尹文清,陳柳生,等.青黛中靛玉紅提取溶劑的改進(jìn)[J]. 廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào).2006,24(3):58-60.