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    香樟愈傷組織的誘導(dǎo)和改良

    2010-01-18 06:47:20
    關(guān)鍵詞:硝酸鉀莖段香樟

    武 蕓

    (生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院),湖北 恩施 445000)

    香樟(Cinnamomumcamphora)又名烏樟、芳樟、樟木等,為樟科樟屬常綠闊葉喬木,是我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的用材、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)樹種,為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種[1],主要分布在我國(guó)的海南、臺(tái)灣、福建、江西、廣東、廣西、湖北、湖南、四川、重慶、云南、貴州、浙江等省市區(qū)[2].其木材材質(zhì)致密,有香氣,耐腐防蟲,為造船、家具和美術(shù)品的上等用材;其樹干、樹蔸、樹根及枝都含有樟油和樟腦,是重要的香料、農(nóng)藥、礦業(yè)、國(guó)防、化工等原料[3].

    香樟在扦插和組織培養(yǎng)方面取得一些進(jìn)展[4~10].采用種子繁殖,會(huì)積累大量變異性狀,不利于香樟優(yōu)良性狀的保留.但扦插繁殖受材料和季節(jié)限制,且繁殖系數(shù)低.利用香樟幼嫩帶芽莖段進(jìn)誘導(dǎo)出了叢生芽,但誘導(dǎo)生根的成功率不高.因此,探索香樟快繁的新途徑很有意義.本次研究香樟愈傷組織的誘導(dǎo)和改良,為后續(xù)組織培養(yǎng)提供源頭和基礎(chǔ),所得優(yōu)質(zhì)愈傷可通過(guò)器官發(fā)生途徑得到完整植株;可用于誘導(dǎo)多倍體,改良品種.

    1 材料與方法

    1.1 材料

    香樟幼嫩的莖段來(lái)自湖北民族學(xué)院校園.

    1.2 方法

    1.2.1 材料的處理 選取初春香樟萌發(fā)的幼嫩莖段作為外植體,用1%的洗潔精浸泡15 min,用小毛刷自下而上順著涮洗4~5次,清洗掉殘留的洗潔精泡沫,自來(lái)水沖洗2~3 h后,在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精中浸泡30 s左右,用0.1%的氯化汞(升汞)溶液振蕩消毒8~10 min(以升汞液面剛好浸沒(méi)外植體材料為宜),用無(wú)菌水沖洗升汞殘留液3~4次,備用.

    1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 以MS為基本培養(yǎng)基,添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì),誘導(dǎo)愈傷組織的形成.將已消毒的外植體(保留腋芽的莖段),切除藥液接觸過(guò)的傷口,剪成約1 cm長(zhǎng)的小段,左右,接入到培養(yǎng)基中,使剪切過(guò)的橫截面?zhèn)?,淺淺的埋入到培養(yǎng)基中,以利于培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和激素等細(xì)胞狀態(tài)調(diào)節(jié)因子在傷口附近的富集,注意外植體在培養(yǎng)基中的位置分布要均勻,成正多邊形,以利于充分利用培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).光照時(shí)間12 h/d,光照強(qiáng)度為40 μmol·m-2·s-1,培養(yǎng)溫度23~25℃.30d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的的形成情況,計(jì)算其誘導(dǎo)率,并觀察所得愈傷組織的顏色和生長(zhǎng)勢(shì).誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體的塊數(shù)×100%.

    1.2.2.1 不同激素及其組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng) 以NAA、6-BA、2,4-D和KT不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為單因子試驗(yàn),觀察它們對(duì)香樟的離體莖段的誘導(dǎo)效應(yīng);根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響.

    1.2.2.2 激素、pH和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng) 采用正交試驗(yàn)的方法,分析激素、pH和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng).

    1.2.2.3 愈傷組織的改良 通過(guò)減少M(fèi)S基本培養(yǎng)基中硝酸鉀的含量,來(lái)降低銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間的比值,達(dá)到對(duì)愈傷組織進(jìn)行改良的目的.分別配制減少硝酸鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1/6、1/5、1/4、1/3的MS培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)15 d,觀察統(tǒng)計(jì).

    表1 NAA、6-BA、2,4-D和KT對(duì)香樟愈傷組織誘導(dǎo)率

    注:-:死亡,+:生長(zhǎng)勢(shì)差,++:生長(zhǎng)勢(shì)一般,+++:生長(zhǎng)勢(shì)較好,++++:生長(zhǎng)旺盛,以下同上.

    表2 不同激素組合對(duì)五鶴續(xù)斷愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 不同植物激素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)

    研究NAA、6-BA、2,4-D和KT對(duì)香樟愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng),結(jié)果表明(見(jiàn)表1):無(wú)論是誘導(dǎo)率還是在生長(zhǎng)勢(shì),2,4-D和KT比6-BA和NAA都具有更高的誘導(dǎo)活性.在添加2,4-D和KT的培養(yǎng)基中,外植體7d左右可觀察到莖段膨脹,切口處有明顯的分裂痕跡,而添加6-BA、NAA的培養(yǎng)基15d左右才觀察到愈傷組織有萌動(dòng)的趨勢(shì).可見(jiàn),在單因子試驗(yàn)中,2,4-D和KT適于誘導(dǎo)香樟愈傷組織,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5 mg/L和1.0 mg/L時(shí)誘導(dǎo)效率最高,生長(zhǎng)勢(shì)較好.

    2.2 不同植物激素組合對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)

    在單因子試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,試驗(yàn)了2,4-D+KT、2,4-D+6-BA以及2,4-D+NAA三種組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響.結(jié)果顯示(見(jiàn)表2),三種激素組合均可誘導(dǎo)出愈傷組織,2,4-D+KT誘導(dǎo)愈傷組織的效率較高,最高達(dá)到了88.7%,因此,誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合為2,4-D(1.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L).

    2.3 激素和蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PH對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

    研究激素和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及PH對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng),結(jié)果表明(見(jiàn)表3):根據(jù)極差R的大小可知影響香樟愈傷組織的誘導(dǎo)因素中,2,4-D>KT>PH>蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),2,4-D影響最大,隨著2,4-D質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,愈傷組織的誘導(dǎo)率升高,在質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的范圍內(nèi),2,4-D質(zhì)量分?jǐn)?shù)跟香樟愈傷組織的誘導(dǎo)率呈正相關(guān)性;觀察表中B列的K值K3

    2.4 愈傷組織的改良

    試驗(yàn)所得到的部分愈傷組織色澤暗淡枯黃,組織結(jié)構(gòu)膨化疏松,在繼續(xù)培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)萎謝,不具備進(jìn)一步分化生長(zhǎng)的能力,通過(guò)減少M(fèi)S基本培養(yǎng)基中硝酸鉀的含量,來(lái)降低銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之間的比值,達(dá)到對(duì)愈傷組織進(jìn)行改良的目的.配制減少硝酸鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1/6、1/5、1/4、1/3的MS培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)15 d,觀察統(tǒng)計(jì).結(jié)果顯示,減少硝酸鉀1/6、1/5,達(dá)不到降低比例的要求,減少1/3,硝酸鉀含量偏低,影響愈傷組織的正常生長(zhǎng),減少1/4為最佳,所得的愈傷組織顏色呈淡綠色,質(zhì)地緊密,生長(zhǎng)旺盛,細(xì)胞胚性強(qiáng),可進(jìn)一步誘導(dǎo)分化.

    3 結(jié)論

    通過(guò)激素和蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及PH的正交實(shí)驗(yàn),得出誘導(dǎo)香樟離體莖段形成愈傷組織的優(yōu)化培養(yǎng)基為:MS+2,4-D(1.5 mg/L)+KT(1.0 mg/L)+20 g/L蔗糖,pH為6.0,愈傷組織誘導(dǎo)率可高達(dá)89.9%.對(duì)所得愈傷組織轉(zhuǎn)入到減少硝酸鉀含量1/4的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,其旺盛生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)致密,可用于誘導(dǎo)分化.

    [1]王青天,林敏惠,陳小寶.樟樹種子育苗技術(shù)[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù),2006(8):26-27.

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