二階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定非酶褐變反應(yīng)中抗壞血酸的含量

鄧啟輝，余愛(ài)農(nóng)

(湖北民族學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

在食品貯藏與加工的過(guò)程中，食品的色澤、香味會(huì)發(fā)生變化，而引起這些變化的原因可能是食品中發(fā)生了非酶褐變(Nonenzymic browning)反應(yīng)，非酶褐變反應(yīng)是食品化學(xué)中最復(fù)雜的反應(yīng)[1]，產(chǎn)物種類繁多，要使其反應(yīng)向著有利于色澤、香味生成的方向進(jìn)行，減少營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失，增加有益產(chǎn)物的積累，提高食品的品質(zhì)，就需要對(duì)食品貯藏與加工過(guò)程中發(fā)生非酶褐變反應(yīng)進(jìn)行深入的研究.而絕大部分食品都含有抗壞血酸，它對(duì)食品貯藏與加工有著重要的影響，因此研究抗壞血酸的非酶褐變反應(yīng)具有更為重要的意義，抗壞血酸的準(zhǔn)確快速測(cè)定也就成了進(jìn)行深入研究的前提.

抗壞血酸的測(cè)定方法一般有碘量法[2]，滴定法[3～6]，雜多酸法[7，8]，紫外分光光度法[9～11]，熒光法[12,13].利用導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)抗壞血酸的含量進(jìn)行測(cè)定也得到了廣泛的應(yīng)用，曾成鳴等[14]對(duì)紫外光譜法直接測(cè)定抗壞血酸含量進(jìn)行了研究，何慧等[15]利用一階導(dǎo)數(shù)光度法測(cè)定了復(fù)方蘆丁片中抗壞血酸的含量，張正權(quán)等[16]利用二階及三階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定了微乳中抗壞血酸的含量，但這些方法在測(cè)定產(chǎn)物種類繁多，顏色較深的非酶褐變食品中的抗壞血酸含量時(shí)很容易受到顏色的干擾而使得測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度不高.M.U. Ozgiir等[17]利用雙波長(zhǎng)三階導(dǎo)數(shù)測(cè)定了蔬菜和水果中的抗壞血酸含量，這種方法雖然對(duì)非酶褐變食品中的抗壞血酸含量的測(cè)定準(zhǔn)確度較高，但數(shù)據(jù)處理較復(fù)雜.本文采用偏磷酸溶液作為提取劑[17]，在抗壞血酸—氨基酸體系[18]中探索出一種用單波長(zhǎng)二階導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定非酶褐變反應(yīng)中的抗壞血酸含量的方法.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

抗壞血酸、偏磷酸、氨基酸(均為分析純)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).UV2501紫外分光光度計(jì)(日本島津)；PHSJ-3F型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；厚壁耐壓反應(yīng)瓶(北京欣維爾玻璃儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備 抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取抗壞血酸 10.000 0 mg用3%(w/v)偏磷酸溶液溶解，稀釋至100 mL；抗壞血酸的標(biāo)準(zhǔn)使用液：吸取儲(chǔ)備液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL用3%(w/v)偏磷酸液稀釋至10 mL(臨時(shí)現(xiàn)配)；3%(w/v)偏磷酸儲(chǔ)備液：稱取15.00 g偏磷酸固體用水溶解，稀釋至500 mL；1%(w/v)偏磷酸使用液：稱取2.50 g偏磷酸固體用水溶解，稀釋至250 mL.2%(w/v)偏磷酸使用液：稱取5.00 g偏磷酸固體用水溶解，稀釋至250 mL；4%(w/v)偏磷酸使用液：稱取10.00 g偏磷酸固體用水溶解，稀釋至250 mL.

1.2.2 樣品的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[18,19]將L-抗壞血酸0.176 1 g (1.00 mmol,0.001 0 mol) 溶解于10.00 ml 0.2 mol/L pH8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，再用固體NaOH在pH計(jì)上調(diào)至pH8，裝入48 mL P160004厚壁耐壓反應(yīng)瓶中，同時(shí)加入0.001 0 mol相應(yīng)氨基酸，密封，在140℃下攪拌反應(yīng)2 h，快速冷卻，為了使樣品中含有微量的抗壞血酸，用截留分子量為500的透析袋透析24 h，將透析后的樣品放入4℃的冰箱中備用.

1.2.3 樣品測(cè)定 取5.00 μL樣品，用3%(w/v)偏磷酸溶液稀釋至10 mL，搖勻，以相應(yīng)濃度的偏磷酸溶液作參比，在200～300 nm范圍內(nèi)掃描，記錄光譜圖和二階導(dǎo)數(shù)光譜圖，求出268 nm處的二階導(dǎo)數(shù)值.用偏磷酸溶液代替樣品，測(cè)定其空白.

2 結(jié)果與分析

2.1 導(dǎo)數(shù)階數(shù)和波長(zhǎng)的確定

用抗壞血酸和半胱氨酸按照1.2.2制備方法制備出樣品溶液.標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的零、一、二階導(dǎo)數(shù)光譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2和圖3，比較二者同階導(dǎo)數(shù)的光譜圖發(fā)現(xiàn)，樣品溶液的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液的二階導(dǎo)數(shù)光譜圖最接近且在268 nm處的吸收最強(qiáng)，所以選定用二階導(dǎo)數(shù)光譜和在268 nm波長(zhǎng)下對(duì)抗壞血酸進(jìn)行測(cè)定.

圖1 零階導(dǎo)數(shù)紫外光譜吸收曲線

圖2 一階導(dǎo)數(shù)紫外光譜吸收曲線

圖3 二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜吸收曲線

2.2 偏磷酸濃度的選擇

分別取抗壞血酸的儲(chǔ)備液(0.1 mg/mL)400.00 μL，用1%，2%，3%，4%的偏磷酸溶液稀釋，定容至10 mL.分別對(duì)上述溶液進(jìn)行光譜掃描，用在268 nm處的二階導(dǎo)數(shù)值和偏磷酸濃度作圖，見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，當(dāng)偏磷酸的濃度達(dá)到3%后，其在268nm處的吸光度的二階導(dǎo)數(shù)值達(dá)到最大.

2.3 溶液穩(wěn)定性的測(cè)定

取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.1 mg/mL)400.00 μL用3%(w/v)偏磷酸液稀釋至10 mL，每?jī)尚r(shí)進(jìn)行一次光譜掃描，對(duì)光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，用其在268 nm下的二價(jià)導(dǎo)數(shù)值與時(shí)間作圖,見(jiàn)圖5.由圖5可見(jiàn)，溶液在常溫下能夠穩(wěn)定8 h以上，能夠滿足測(cè)定的需求.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別量取0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用3%(w/v)偏磷酸液稀釋至10 mL，進(jìn)行光譜掃描，對(duì)光譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，用其在268nm下的二階導(dǎo)數(shù)與其濃度作圖，見(jiàn)圖6.

圖4 偏磷酸濃度對(duì)吸光度的影響

圖5 時(shí)間對(duì)溶液穩(wěn)定性的影響

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由結(jié)果可見(jiàn)，抗壞血酸含量在1.00～12.00 μg/mL間線性關(guān)系良好，經(jīng)計(jì)算處理，回歸方程為：

C=6721.304 A-0.058 8，線性相關(guān)系數(shù)為 γ=0.999 9.

2.5 樣品測(cè)定和回收率試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法，對(duì)L-抗壞血酸與半胱氨酸，賴氨酸，精氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸五種氨基酸發(fā)生非酶褐變反應(yīng)后產(chǎn)物中的抗壞血酸含量進(jìn)行了測(cè)定，然后加入定量抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算相對(duì)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 樣品測(cè)定及回收率試驗(yàn)

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定及回收結(jié)果表明，本法的回收率在96.50%～103.75%之間，回收效果良好，說(shuō)明利用該方法對(duì)非酶褐變中的抗壞血酸的測(cè)定是可行的，并且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠.

[1]汪東風(fēng)，孫麗平，張莉.非酶褐變反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2006(10):9-19.

[2]布都會(huì)，高莉,徐向莉，等.碘量法測(cè)定維生素C的改良[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2004,22(1):195-198.

[3]中國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(第2部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.

[4]菀乃香，宣亞文，謝東坡，等.2，6-二氯靛酚鈉測(cè)定蔬菜中抗壞血酸含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(25):11 853-11 854.

[5]蔡凌霜，徐昊,張玉清.微量滴定法測(cè)定抗壞血酸(Vc)含量[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2004,19(5):521-523.

[6]王建國(guó)，王瑞斌.高錳酸鉀滴定法快速測(cè)定蔬菜中抗壞血酸含量[J].食品科學(xué),2008,29(10):471-473.

[7]宋豐.磷鉬雜多酸光度法測(cè)定水果、蔬菜、藥物中抗壞血酸[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2001,35(3):309-313.

[8]王占文，陳玉鑾.磷鉬雜多酸法測(cè)定藥物和食品中抗壞血酸[J].分析化學(xué),1991,19(3):357-361.

[9]謝紅偉.紫外分光光度法測(cè)定獼猴桃中Vc含量[J].食品科技,2003(4):80-81.

[10]孫國(guó)良，陳金媛,湯斌華，等.軟飲料中Vc含量的測(cè)定[J].食品科學(xué),1998,19(2):36-38.

[11]陸茜，陳鳳群，萬(wàn)昆.紫外分光光度法測(cè)定維生素C含量[J].江漢大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005,33(2):68-69.

[12]孫振艷，趙中一，郭小慧，等.熒光分析法測(cè)定維生素C含量[J].化學(xué)分析計(jì)量,2006,15(4):18-20.

[13]童裳倫.熒光光度法測(cè)定維生素C含量[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：理學(xué)版,2001,28(5):542-546.

[14]曾成鳴，易鋼.紫外導(dǎo)數(shù)光譜法直接測(cè)定抗壞血酸含量[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),1993(1):98-101.

[15]何慧，祁建斌，劉凡.一階導(dǎo)數(shù)光度法測(cè)定復(fù)方蘆丁片中維生素C含量[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,1995,14(6):607-610.

[16]張正權(quán)，陸彬，楊秀岑.導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定微乳中維生素C的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2001,16(1):46-47.

[17]Ozgiir, M U,Sungur S.Third order derivative spectrophotometric determination of ascorbic acid in fruits and vegetables[J].Talanta,1995，42:1 631-1 640.

[18]YU A N, Zhang A D. The effect of pH on the formation of aroma compounds produced by heating a model system containing L-ascorbic with L-threonine/ L-serine [J].Food Chemistry, 2010,119(1):214-219.

[19]劉應(yīng)煊，史玉芳，余愛(ài)農(nóng).抗壞血酸與半胱氨酸Maillard反應(yīng)的揮發(fā)性產(chǎn)物的提取與鑒定[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2009,26(3):241-247.