金霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

高 山，李寧環(huán)，胡 平，何義發(fā)

(1.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000;2.恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，湖北 恩施 445000)

金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)，是鏈霉菌(Streptomyces)的一種，因能產(chǎn)生金霉素(chlortetracycline，即CTC)而得名.金霉素(CTC)是屬于四環(huán)素類的一種廣譜抗生素，在醫(yī)療、畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)上有廣泛的用途，尤其在畜牧業(yè)上是用于飼料藥物添加劑的八大抗生素產(chǎn)品之一.金霉素以其抑菌、促生長、飼料利用率高、在肌體內(nèi)殘留量低的特點以及其生產(chǎn)技術(shù)成熟和生產(chǎn)成本低的優(yōu)點，成為了目前及今后較長一段時間內(nèi)在飼料工業(yè)中用量最大的抑菌促生長劑.金霉素的生物合成很復(fù)雜，影響金霉素發(fā)酵的因素也很多，如種子質(zhì)量、培養(yǎng)基組成、工藝條件以及發(fā)酵過程的代謝調(diào)控等[1].關(guān)于金霉素的研究多是從影響金霉素發(fā)酵的工藝條件[2]或者代謝調(diào)控方面[3]著手，目前還沒有專門針對發(fā)酵培養(yǎng)基組成方面的研究報道.本研究通過外在條件的控制并調(diào)整培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分來達到高效生產(chǎn)四環(huán)素類抗生素的目的，為工業(yè)化生產(chǎn)此類抗生素及科學(xué)研究提供一個理論和應(yīng)用基礎(chǔ).目前關(guān)于鏈霉菌培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究報道，僅僅采用單因素法，如研究接種量、種齡、酵母粉、溫度、PH等對金霉素發(fā)酵的影響[1]，也有通過物理或化學(xué)誘變選育金霉素高產(chǎn)菌的研究[4]，及通過原生質(zhì)體誘變金霉素鏈霉菌育種的研究[5]，等.一般都是通過搖瓶發(fā)酵后再上大發(fā)酵罐進行生產(chǎn)性能測定.本文借鑒了前人的部分研究成果，先采用單因素試驗，隨后利用正交設(shè)計優(yōu)化金霉素鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)基.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金霉素鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)，購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(Agricultural Culture Collection of China， ACCC)，菌株編號為ACCC40090.生物測定指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus),來自湖北民族學(xué)院生物基礎(chǔ)實驗教學(xué)示范中心保藏菌株.

1.1.2 標準品 金霉素標準品購自北京萬誠博達科貿(mào)有限公司.

1.1.3 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基[6].種子培養(yǎng)基(%)[4]：玉米淀粉4.0，黃豆粉2.0，氯化鈉0.2，硫酸銨0.3，碳酸鈣0.4，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，硫酸鎂0.025，磷酸二氫鉀0.025，pH7.0～7.2.發(fā)酵培養(yǎng)基(%)[1～4,7]：玉米淀粉，蛋白胨，酵母膏，硫酸銨，氯化鈉，磷酸二氫鉀,硫酸鎂等.

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與培養(yǎng) 分別配制高氏1號液體和固體斜面培養(yǎng)基，滅菌.將預(yù)先保藏在冷凍干燥管中的金霉素鏈霉菌菌種在無菌操作臺上先用挫刀或鑷子直接敲下安瓿管的頂端，若敲下的孔口太小，可用滅菌的鑷子處理孔口處，使開口處為合適大小即可.用無菌吸管，吸取0.3～0.5 mL適宜的液體培養(yǎng)基，滴入安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀.取0.1～0.2 mL菌體懸浮液，移植于適宜的瓊脂斜面，剩余的菌液(3～4 mL)，注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi)，然后在30℃下培養(yǎng)，液體搖瓶在200 r/min下震蕩培養(yǎng).將活化培養(yǎng)一天的菌種轉(zhuǎn)接試管斜面，同樣溫度條件下培養(yǎng)4～5 d，即可見斜面孢子生長良好，于4℃冰箱中保藏.

根據(jù)試驗需要配制一定量牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分裝一定數(shù)量的試管斜面，余下的用250 mL三角瓶保存待用.將試管斜面上的指示菌種金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)接于新鮮的試管斜面若干，37℃培養(yǎng)待生長良好時置于4℃冰箱中保藏，作為試驗用的指示菌種.

1.2.2 種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制 按配方配制，加有一定量玻璃珠，以使搖瓶中的菌種分散并均勻而快速的生長,具體配制過程可以參考文獻[7].

1.2.3 種子培養(yǎng) 將高氏1號斜面上生長良好的菌體用接種鉤挑取1.0 cm2左右的菌體放入種子搖瓶里，由于鏈霉菌菌落與培養(yǎng)基連接緊密，不易挑起，因此可以連同培養(yǎng)基一起放入裝液量為50 mL/250 mL[2,4]種子搖瓶.在30℃，230 r/min下震蕩培養(yǎng)20～24 h[2,4,8].

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)(搖瓶培養(yǎng)) 將震蕩培養(yǎng)24 h的種子培養(yǎng)液用10 mL移液管各取5 mL(接種量10%)到各個發(fā)酵搖瓶里，發(fā)酵搖瓶的裝液量為50 mL/250 mL，在30℃，230 r/min下震蕩培養(yǎng)5 d后放瓶[2,4].

1.2.5 金霉素生物效價的測定 采用管碟法[9]測定發(fā)酵液中金霉素的生物效價.將標準品制成效價為10、20、50、100和200 μg/mL的濃度梯度，用濃度為108個/mL的金黃色葡萄球菌菌懸液適量為指示菌，于30℃培養(yǎng)24 h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小，每個效價濃度3次重復(fù)，每個重復(fù)測定2次，根據(jù)抑菌圈直徑大小和標準品濃度的關(guān)系繪制標準曲線.測量時，將待測發(fā)酵液的抑菌圈直徑帶入標準曲線，得出樣品的生物效價.

1.2.6 單因素試驗

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基中主要碳源篩選

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基中主要氮源篩選

表3 4因素3水平正交試驗表L9(34)

圖1 管碟法標準曲線

1.2.6.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中主要氮源的篩選 發(fā)酵培養(yǎng)基中所用的氮源種類豐富，可以同時選用多種氮源[1,2,4]，故在本次試驗中選擇無機氮源和有機氮源搭配.在單因素試驗1.2.6.1的基礎(chǔ)上，固定培養(yǎng)基中其它成份，變換培養(yǎng)基中主要氮源種類和搭配，保持C/N比約為2∶1[4,7]，考察不同N源對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)抗生素的影響.本次試驗分4組，具體組成如表2所示.培養(yǎng)基中其它成份為：酵母膏4.0 g，磷酸二氫鉀1.5 g，氯化鈉1.5 g，硫酸鎂0.1 g，碳酸鈣6.0 g,水1 000 mL,調(diào)pH為7.0～7.2.

1.2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交設(shè)計試驗 正交試驗采用4因素3水平，9組試驗，每組3個重復(fù).4因素分別為玉米淀粉，黃豆粉，硫酸銨，酵母粉.其中主要碳源和氮源由單因素試驗確定，生長因子及各因素水平范圍參考相關(guān)研究論文經(jīng)比較確定[2,4,10].各因素水平表如表3所示.

2 結(jié)果與分析

2.1 金霉素生物效價標準曲線的測定

按照方法1.2.5測定不同濃度梯度的標準品產(chǎn)生的抑菌圈直徑，其結(jié)果見表4，根據(jù)表4繪制出標準曲線(如圖1)，求得回歸方程：y=0.1266x-0.5855；相關(guān)系數(shù)：R2=0.997 8.試驗結(jié)果表明：金霉素濃度在10～200 μg/mL范圍內(nèi)，抑菌圈直徑和效價的對數(shù)值成線性關(guān)系，多次重復(fù)試驗，結(jié)果重現(xiàn)性好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上.

表4管碟法測得的不同濃度標準品的抑菌圈直徑

Tab.4 The diameter in different concentrations by cylinder-plate method

抑菌圈直徑/mm標準品濃度/μg·(mL)-1102050100200d112.4614.6217.8820.5622.46d212.4414.6817.4220.8422.74d312.6414.5818.1620.6222.30d412.5614.6018.0820.6622.24d512.8015.1217.9820.8223.04d612.7615.2018.0220.8623.10平均值12.6114.8017.9220.7322.65

2.2 金霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中主要碳源的確定

以表1中的組合作為碳源進行發(fā)酵試驗，最后將經(jīng)過120 h的發(fā)酵液用管碟法平板培養(yǎng)18～24 h后，用游標卡尺測量抑菌圈，每個平板中3個重復(fù)，計算其平均值，結(jié)果如表5.

8組試驗與對照組相比，其抑菌圈直徑均比對照組大，說明高氏液體培養(yǎng)基不是適合試驗菌種產(chǎn)抗生素的培養(yǎng)基.1～4組和5～8組比較可知，加了耐高溫淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生抗生素的能力普遍偏低，抑菌圈沒有或者較小，而以含淀粉的物質(zhì)為原料作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的主要碳源成份，其發(fā)酵產(chǎn)抗生素的能力普遍較高.由表5可以看出，玉米淀粉組(組1)抑菌圈最大，其生物效價最高，達118.3 μg/mL,說明試驗菌種在發(fā)酵過程中對玉米淀粉的吸收和利用能力較高，且有利于抗生素這種次級代謝產(chǎn)物的生成，這說明玉米淀粉是此發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳碳源.

表5 主要碳源篩選試驗結(jié)果

表6 主要氮源篩選試驗結(jié)果

2.3 金霉素鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基中主要氮源的確定

以篩選出的玉米淀粉為培養(yǎng)基中主要碳源，以硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、黃豆粉為主要氮源進行氮源的篩選試驗，結(jié)果顯示(見表6)，不同氮源對金霉素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生抗生素的影響很大，第1組和第3組的抑菌圈明顯比第2組和第4組小；由第1組和第3組及第2組和第4組的結(jié)果比較可知，在含有相同無機氮源的情況下，比較有機氮源黃豆粉和蛋白胨發(fā)現(xiàn)，試驗菌種在發(fā)酵過程中對黃豆粉的利用率更高；由第1組和第2組及第3組和第4組的結(jié)果對比可知，在含有相同有機氮源的情況下，比較無機氮源硝酸鉀和硫酸銨發(fā)現(xiàn)，試驗菌發(fā)酵對硫酸銨的利用率更高.由第2組和第4組可知，無機氮源硫酸銨和有機氮源黃豆粉組合是最優(yōu)組合，故選擇以硫酸銨和黃豆粉為發(fā)酵用主要氮源.具體結(jié)果如表6所示.

2.4 正交試驗結(jié)果分析

在確定了單因素的最佳培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上，設(shè)計了培養(yǎng)基中玉米淀粉、黃豆粉、硫酸銨和酵母粉的4因素3水平正交組合試驗(表7).從表7中可以看出，第1組試驗組合為最優(yōu)水平組合，即當玉米淀粉為100.0 g/L，黃豆粉為50.0 g/L，硫酸銨為6.0 g/L，酵母粉為4.0 g/L時，在此最優(yōu)水平組合條件下，生物效價為183.2 g/mL，是對照組(高氏培養(yǎng)基)的38倍.對試驗結(jié)果進行極差分析，求得每個因素在每個水平下的平均值(用K1，K2，K3表示)，并求出其極差R.K值大致反映了每因素的每個水平對試驗結(jié)果的影響，如表7中玉米淀粉這個因素，K1>K2>K3，這說明玉米淀粉這個因素的第1個水平對試驗結(jié)果影響最大，第3個水平影響最??；R值為每個因素中3個水平K值的最大值和最小值之差，它反映了某個因素水平的改變對試驗結(jié)果的影響大小，R值越大，則對應(yīng)的這個因素對試驗結(jié)果的影響越大.結(jié)果表明(見表7)，正交試驗使金霉素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)抗生素的能力得到了進一步的提高.各因素對抗生素產(chǎn)量影響的主次順序為酵母粉>玉米淀粉>黃豆粉>硫酸銨，這說明，酵母粉含量對抗生素的產(chǎn)量影響最大，其次為玉米淀粉濃度，再次為黃豆粉濃度，硫酸銨濃度對抗生素的產(chǎn)量影響最小.

表7 正交試驗結(jié)果與分析

3 結(jié)論與討論

本研究得出金霉素鏈霉菌發(fā)酵時對玉米淀粉利用率較高，且不需添加相應(yīng)的淀粉酶水解.能有效利用無機氮源，在無機氮源中，對銨鹽的利用率要比對硝酸鹽的利用率高很多，其原因可能是硝酸鹽在菌體內(nèi)要首先轉(zhuǎn)化成銨鹽才能很好地被利用，而現(xiàn)成的銨鹽則可以直接被利用.此菌對有機氮源的利用率也很高，其原因可能是有機氮源中包含各種營養(yǎng)成分，補充了培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)成分的不足. 在單因素試驗基礎(chǔ)上進一步通過4因素3水平的正交試驗得出金霉素鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)四環(huán)類抗生素的最佳培養(yǎng)基組成為：玉米淀粉100.0 g/L，黃豆粉50.0 g/L，硫酸銨6.0 g/L，酵母粉4.0 g/L.經(jīng)正交優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基可使試驗菌種發(fā)酵液的生物學(xué)效價達到最大.對正交結(jié)果進行極差分析顯示，酵母粉含量對抗生素產(chǎn)量影響最大，硫酸銨最小.

培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分理論上雖然包含六大類營養(yǎng)要素，而每種營養(yǎng)要素對菌體的生長都起著重要作用，但每種營養(yǎng)要素(除水外)的種類豐富，尤其是碳源，氮源.可以作為碳源的營養(yǎng)物很多，分為有機碳源和無機碳源，而有機碳源又有很多種，如單糖、多糖、有機酸、醇和酯、淀粉、糖蜜、氨基酸、蛋白質(zhì)等，還有許多成分復(fù)雜的物質(zhì)，如牛肉膏、花生餅粉等，無機碳源如CO2和碳酸鹽；氮源也可分為有機氮源和無機氮源，有機氮源如尿素、氨基酸、蛋白質(zhì)、牛肉膏、蠶蛹粉等，無機氮源如N2、銨鹽、硝酸鹽.不同的微生物對不同的營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力不同，對同一種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力也不一定相同.若要全面考察某種微生物對某種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用能力，工作量是相當大的，因此目前為止，還沒有專門全面優(yōu)化設(shè)計發(fā)酵培養(yǎng)基的研究報道，目前僅有的很少的一部分是關(guān)于培養(yǎng)基優(yōu)化的，則是根據(jù)相關(guān)資料確定的因素進行正交設(shè)計.本研究的優(yōu)勢在于先查閱多種資料，確定可行的適合試驗菌種生長并對其影響較大的碳源，氮源，為正交篩選提供一個試驗與理論依據(jù)，如條件允許，可以做選擇更多不同的營養(yǎng)物質(zhì)進行發(fā)酵試驗測定其抗菌譜進而比較其優(yōu)劣.

測定抗生素效價的方法有物理學(xué)方法、化學(xué)方法和生物學(xué)方法.由于生物學(xué)方法是以對供試菌的抑菌強度為標準，與臨床應(yīng)用的目的相符，且有靈敏度高、使用樣品少等優(yōu)點，因此被廣泛使用.生物效價可用稀釋法、比濁法或擴散法測定，其中以擴散法中的管碟法最為常用.它是將已知濃度的標準抗生素溶液與未知濃度的試樣溶液分別滴到豎置于含有標準供試菌株懸液的瓊脂平板上的幾個標準不銹鋼小管(舊稱“牛津小杯”)中，邊培養(yǎng)邊擴散，經(jīng)過一段時間后，測量供試菌抑制圈的直徑，并與標準曲線作比較后即可測出某試樣的效價[11].此外，還有比色法[8]，高效液相色譜法[7]等.另外，本研究所用的指示菌株與其它供試菌種相比[4]，對于金霉素鏈霉菌發(fā)酵液的抑菌圈測定用金黃色葡萄球菌作為供試菌種較好，因其能混合在培養(yǎng)基中生長呈現(xiàn)金黃色，與產(chǎn)生的抑菌圈對比鮮明.

[1]扶教龍，儲炬，張明,等.金霉素發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2002，33(12):583-587.

[2]扶教龍,張明,樊濤,等.金色鏈霉菌培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].華東理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2004,30(1):43-47.

[3]扶教龍，儲炬，劉玉偉,等.金霉素發(fā)酵過程的代謝特性及調(diào)控策略[J].中國抗生素雜志,2002,27(3):141-145.

[4]軒海連.金霉素高產(chǎn)菌的選育及發(fā)酵工藝的研究[J].工業(yè)微生物,2003,33(4):20-22.

[5]賀筱蓉，李永泉，趙小立,等.原生質(zhì)體誘變選育去甲基金霉素高產(chǎn)菌[J].杭州大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1997,24(2):170-177.

[6]周德慶.微生物學(xué)教程(第2版)[M].北京：高等教育出版社,2002:82-86,184.

[7]趙斌，何紹江.微生物學(xué)實驗[M].北京：科學(xué)出版社,2002:86-87.

[8]謝昌賢，劉運添，王鵬飛,等.衛(wèi)星搭載選育金霉素高產(chǎn)菌的研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,37(6):651-656.

[9]黃晶，劉峰，劉勇.硫酸二乙酯和紫外線對金霉素鏈霉菌的誘變育種[J].中國抗生素雜志,2002,27(3):138-141.

[10]趙剛，吳元華.一株鏈霉菌發(fā)酵液的抗菌譜及穩(wěn)定性[J].農(nóng)藥,2006,45(8):525-528.

[11]劉金國，劉學(xué)銘，程新，等.響應(yīng)面法優(yōu)化鏈霉菌702產(chǎn)抑真菌物質(zhì)生料發(fā)酵培養(yǎng)基[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,30(1):131-135.