CADM1基因甲基化與宮頸鱗癌及癌前病變的相關性研究

譚秋芬,賈 薇,胡丹妮,李 鋒,陶 林,梁偉華,潘曉琳

(新疆地方病與民族高發(fā)病重點實驗室,石河子832002)

本研究采用MassARRY Epi TYPER DNA甲基化分析技術定量分析宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常對照組中CADM1基因啟動子區(qū)15個CpG位點的甲基化狀態(tài),探討CADM1基因CpG位點甲基化狀態(tài)與宮頸鱗癌發(fā)生機制的關系。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院2007～2009年間石蠟包埋組織,宮頸鱗癌49例,CIN2/347例,CIN128例,對照宮頸組織24例(為子宮肌瘤行全子宮切除術后,經(jīng)病理診斷證實無宮頸病變)。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取DNA 將10～15張約5um厚石蠟包埋組織蠟膜置于2.0mL消毒離心管中;經(jīng)二甲苯脫蠟,無水乙醇脫苯,細胞裂解液及蛋白酶 K消化,苯酚-氯仿-異戊醇抽提,無水乙醇沉淀,適量 TE(pH=8.0)溶解DNA,沉淀12～24h后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA質(zhì)量鑒定 所提取DNA均經(jīng)β-globin PCR擴增檢測DNA是否提取成功,使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度儀檢測DNA濃度和純度。1.2.3 DNA亞硫酸氫鹽處理 使用 EZDNA甲基化處理試劑盒(Zymo Research,Orange County,CA)處理DNA,按照試劑盒提供步驟操作。

1.2.4 CADM1基因甲基化檢測 采用MassARRY Epi TYPERDNA甲基化分析技術技術(Sequenom,SanDiego,CA)定量分析CADM1基因的甲基化狀態(tài)。使用MassCLEAVE試劑盒(Sequenom)應用PCR法在384孔板上擴增目的基因片段,加入蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)混合液去除反應體系中游離的核苷酸,對PCR產(chǎn)物進行體外轉錄,加入樹脂清除離子成分,混勻離心裂解反應液后備用。使用MassARRAY Nanodispenser (Sequenom,SanDiego)從384孔板裂解反應液中取出22nL入基質(zhì)芯片(Spectro-CHIPs;Sequenom,SanDiego),MassARRAY質(zhì)譜儀(Bruker-Sequenom)收集質(zhì)譜圖,經(jīng) EpiTYPER v1.0軟件(Sequenom)進行分析。

1.2.5 HPV16E6DNA檢測 采用 PCR法檢測HPV16DNA,選用課題組前期經(jīng)測序確定為HPV16陽性樣本為陽性對照,PCR擴增未見特異性目的片段的樣本為陰性對照,空白對照以高壓消毒雙蒸水代替DNA模板,取2μLPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,BIO-RAD凝膠成像圖像分析儀觀察結果。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1Primer sequences

1.3 統(tǒng)計學方法

采用 SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。運用Kruskal-WallisH檢驗和相關分析。運用Cluster3.0軟件和TreeView軟件進行聚類分析。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DNA質(zhì)量鑒定

結果見圖1。由圖 1可見,β-globinPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,均在268bp處出現(xiàn)目的片段(圖1),DNA純度 OD260/OD280在1.7～2.0之間,DNA濃度>50ng/μL,樣本 DNA均可用于PCR擴增。

圖1 β-globin PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretogram ofβ-globin amplified products

2.2 CADM1基因在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1及正常組中的甲基化檢測結果

利用MassARRY Epi TYPER質(zhì)譜儀分析提供的圖譜數(shù)據(jù),精確定位到基因片段每個CpG單位的甲基化狀態(tài),用甲基化率量化每個CpG單位的甲基化程度。本實驗148例樣本,每例樣本擴增子中包含10個CpG單位(擴增子中包含15個CpG位點,經(jīng) T切后分為10個CpG單位,每個CpG單位包含單個或多個CpG位點),CpG單位總數(shù)為1480個,其中 1402個 CpG單位可被分析,可分析率達94.7%。1402個可被分析的CpG單位中,平均甲基甲率<30%的CpG單位為1227個,占87.5%,甲基化水平較低,甲基化率>90%的CpG單位為140個,占1.0%。應用雙向聚類分析描繪宮頸鱗癌(n=49)、CIN2/3(n=47)、CIN1(n=28)與正常組(n=24)中的CADM1基因10個CpG單位甲基化率的分布趨勢,如圖2,顯示宮頸鱗癌組甲基化率高于CIN2/3、CIN1及正常對照組。

圖2 CADM1基因在宮頸148例樣本中的甲基化狀態(tài)聚類分析Fig.2Cluster diagram depicting Cp G Units methylation of CADM1

宮頸不同病變中,CADM1基因各CpG單位呈現(xiàn)不同水平的甲基化,CpG_2·3·4·5位點平均甲基化率在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常組均較高,平均甲基化率約50%;CpG_7、CpG_9.10位點平均甲基化率在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常組均較低,平均甲基化率<10%,如圖3。

圖3 CADM1基因CpG單位在正常、CIN1、CIN2/3、宮頸鱗癌組的平均甲基化率Fig.3 Group mean methylation of the Cp G units of CADM1

應用 Kruskal-WallisH檢驗,顯示宮頸鱗癌組CpG_1、CpG_8、CpG_11、CpG_15位點甲基化率高于CIN2/3、CIN1及正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),如表2。CIN2/3、CIN1及正常組間甲基化率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1及正常對照組中CADM1基因CpG單位甲基化狀態(tài)的比較Tab.2 The comparison of individual Gp G units methylation of CADM1 ,bettween different cervical lesions and normal average

2.3 宮頸鱗癌中 CADM1基因甲基化與HPV16感染的相關性

應用相關分析顯示,CADM1基因CpG_8、CpG_11、CpG_15甲基化水平與 HPV16感染呈正相關(HPV16陽性樣本36例,陰性樣本13例),有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 宮頸鱗癌中HPV16檢測陽性與陰性樣本CADM1基因甲基化狀態(tài)比較Tab.3 Relationship of individual Cp G units methylation of CADM1 between HPV16 positive samples and negative sample s

3 討論

本文對CADM1基因啟動子區(qū)15個CpG位點進行分析發(fā)現(xiàn),在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常組中,CpG_2·3·4·5位點平均甲基化率均較高,CpG_7、CpG_9.10位點平均甲基化率均較低,不同CpG位點甲基化程度不同。宮頸鱗癌CADM1基因啟動子區(qū)甲基化水平高于 CIN2/3、CIN1、正常組,其中CpG_1、CpG_8、CpG_11、CpG_15四個位點甲基化率在宮頸鱗癌中明顯高于CIN2/3、CIN1及正常組,CIN2/3、CIN1及正常組間CpG位點甲基化水平無顯著差異。提示CADM1基因啟動子區(qū)特異性位點甲基化狀態(tài)的改變可能在促進CIN向宮頸鱗癌轉化的過程中起著一定的作用。CADM1基因編碼的跨膜糖蛋白羧基端包括 FERM-和 PDZ-結合模序[10],FERM-和 PDZ-結合模序分別與 MPP3和DAL-1連接形成復合體,并與細胞骨架連接,可能與細胞增殖、細胞粘附、腫瘤抑制和免疫逃逸有關[11～13]。CADM1基因表達沉默在宮頸腫瘤中是頻發(fā)事件,伴有或不伴有等位基因缺失的啟動子區(qū)甲基化是CADM1基因失活的主要方式[11]。CpG島通常位于基因的5′端啟動子區(qū),也可延伸至基因的外顯子區(qū),啟動子區(qū)的CpG被甲基化時基因轉錄受到抑制。有學者提出,基因啟動子區(qū)CpG甲基化的密度與轉錄的抑制程度有關[14]。Steenbergen等[11]研究顯示,在宮頸鱗癌及 CIN2/3組中CADM1基因啟動子區(qū)所有CpG島均發(fā)生了甲基化,其檢出率分別為58%和35%,認為宮頸鱗癌中CADM1基因甲基化頻率高、范圍廣。Overmeer等[6]以CADM1基因啟動子區(qū)的三個區(qū)域為靶點,結果顯示高密度(≥2個區(qū)域)甲基化與蛋白表達減低有關,且在宮頸病變≤CIN1組與≥CIN3組之間有顯著差異,而單個區(qū)域甲基化在正常組和CIN1組中占有較大比例,認為高密度甲基化可以作為診斷宮頸鱗狀上皮CIN3及以上病變的有效指標。另有研究認為DNA建立的甲基化模式是有區(qū)域特異性的,并非所有的CpG位點甲基化敏感度都一樣,少數(shù)CpG位點甲基化就可能有效地消弱基因啟動子的活性[15,16]。有學者應用MassARRYEpiTYPERDNA甲基化分析技術檢測前列腺腫瘤中8個基因的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn) RARB2基因CpG_10.11位點甲基化評分診斷前列腺癌的靈敏度和特異度分別為90.0%,92.59%,認為基因單個CpG位點甲基化的改變可以用于腫瘤的診斷[17]。因此,本研究結果提示特定CpG位點甲基化狀態(tài)的改變可能導致了基因表達沉默,造成腫瘤抑制喪失,在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

本研究中,在宮頸鱗癌中CADM1基因CpG_8、CpG_11、CpG_15三個位點的甲基化水平與HPV16感染呈正相關,提示 CADM1基因特定CpG位點的高甲基化狀態(tài)可能與 HPV感染協(xié)同導致了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。近年來研究證實單獨HPV感染不足以引起 HPV相關性腫瘤(如宮頸癌)的發(fā)生,遺傳和其他因素一起導致了侵襲性表型的形成。研究顯示 HPVDNA感染細胞必須獲得永生化表型和停泊非依賴性生長表型才能具有致瘤性,所有這些表型都為隱性性狀,提示這些表型可能與抑癌基因表達缺失有關[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)在人類纖維母細胞中11p缺失與 HPV16誘導的停泊非依賴性有關,當人類11號染色體被導入到 Hela和SiHa細胞株中,其致瘤性喪失,表明11號染色體上存在抑癌基因[19]。早期發(fā)現(xiàn)11q23.2缺失中有一特殊的約700kb的區(qū)域能完全抑制肺癌細胞株A549的惡性表型,通過功能互補研究發(fā)現(xiàn)其抑制作用主要依賴其中100kb的區(qū)域,而CADM1是該區(qū)惟一基因[13]。高危型 HPV感染的CIN2/3到宮頸癌的演進過程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)由于啟動子甲基化引起的CADM1基因表達沉默,但是CADM1mRNA在非瘤性 HPV永生化細胞株中表達豐富,提示CADM1基因表達沉默可能與 HPV永生化到致瘤性表型的轉化有關[11]。

本研究通過對CADM1基因多個CpG位點甲基化狀態(tài)定量分析,認為CADM1基因特異性位點CpG_1、CpG_8、CpG_11、CpG_15的甲基化可能促進了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展,其中 CpG_8、CpG_11、CpG_15的甲基化可能與 HPV永生化到致瘤型表型的轉化有關。CADM1基因特異性CpG位點甲基化狀態(tài)的改變可能導致基因轉錄表達沉默,可能是宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的促進因素。

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