新鮮哈密瓜汁中芽胞菌的分離鑒定及超高壓對(duì)其致死效應(yīng)研究

姜海榮,尹琳琳,宋麗軍,于小燕,陳計(jì)巒

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,石河子832003)

新鮮哈密瓜汁中芽胞菌的分離鑒定及超高壓對(duì)其致死效應(yīng)研究

姜海榮,尹琳琳,宋麗軍,于小燕,陳計(jì)巒

(石河子大學(xué)食品學(xué)院,石河子832003)

為探討哈密瓜汁超高壓殺菌的新方法,以新鮮哈密瓜為試驗(yàn)材料,通過(guò)形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒定方法分離得到2株芽胞菌,采用細(xì)菌16Sr RNA基因的通用引物進(jìn)行PCR并擴(kuò)增出這2株菌的16Sr RNA基因全序列。測(cè)定16S r RNA基因序列,將獲得的序列用blast軟件與 Genbank中相關(guān)菌株的16SrDNA序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示兩菌株均為枯草芽孢桿菌。采用100～500MPa超高壓協(xié)同35～55℃處理5～20 min進(jìn)行枯草芽孢桿菌的殺菌實(shí)驗(yàn),結(jié)合哈密瓜汁的理化指標(biāo)和最大程度保持哈密瓜汁原有特殊風(fēng)味,得出45℃、300MPa、保壓15min為殺菌的最優(yōu)參數(shù),能使哈密瓜汁中的枯草芽孢桿菌降低5.23個(gè)對(duì)數(shù)。

芽胞菌;分離鑒定;超高壓;殺菌;哈密瓜汁

新疆是我國(guó)最大的哈密瓜產(chǎn)區(qū)。新鮮哈密瓜汁色澤為金黃色,處于均勻的混合狀態(tài),是一種很有市場(chǎng)潛力的果汁。但哈密瓜屬于熱敏性瓜果,熱加工中面臨的主要問(wèn)題是風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)的變化—變味(產(chǎn)生南瓜味)、香氣損失、色澤變化、營(yíng)養(yǎng)降低,并產(chǎn)生脂肪氧化的酸敗氣味,令人無(wú)法接受。目前哈密瓜汁加熱變味一直是食品研究者關(guān)注和努力解決的世界性難題,已成為我國(guó)甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[1]。

現(xiàn)階段非熱殺菌技術(shù)已廣泛應(yīng)用熱敏性瓜果汁的加工過(guò)程中,超高壓殺菌不僅能保證食品在微生物方面的安全,而且能較好地保持食品固有的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、色澤、新鮮程度等,是一種非常有發(fā)展前景的技術(shù)。這一技術(shù)在一些發(fā)達(dá)國(guó)家已運(yùn)用于液體和固體食品的殺菌中,超高壓殺菌技術(shù)也日趨成熟[2～4]。

果汁在應(yīng)用超高壓加工過(guò)程中要解決的主要問(wèn)題之一就是殺滅其中的優(yōu)勢(shì)微生物,通常芽孢桿菌種群,耐壓耐熱,在果汁殺菌中,極不易被殺死,它們的殘存是果汁產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵因素[5]。因此在殺菌前有必要對(duì)果汁中耐熱耐壓芽孢桿菌進(jìn)行鑒定,本文采用新鮮哈密瓜汁為原料,分離其中的耐熱耐壓的芽胞菌,并針對(duì)熱敏性果汁特點(diǎn),采用超高壓對(duì)哈密瓜汁進(jìn)行處理,研究超高壓對(duì)枯草芽胞桿菌的致死效應(yīng),為哈密瓜汁的超高壓殺菌開(kāi)辟一條途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料菌種及儀器設(shè)備

材料:新疆哈密瓜,品種為伽師瓜(p H 6.5,9.5 Brix);儀器設(shè)備:SW-CJ-100型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、SPX-250B-2型生化培養(yǎng)箱(上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司)、TC-512型 PCR儀(Barloworld公司產(chǎn)品)、Gel Dox TM XR 170-8170型凝膠成像系統(tǒng)(Blo-RAD公司產(chǎn)品)、HPP.L2型超高壓處理設(shè)備(天津市華泰森淼超高壓設(shè)備有限公司)。

1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)瓊脂肉湯培養(yǎng)基(NA),營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB),AAM培養(yǎng)基

1.3 新鮮哈密瓜汁中耐熱菌的分離實(shí)驗(yàn)

每次取新鮮伽師瓜4個(gè),分三組進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。將哈密瓜進(jìn)行表面消毒處理,去皮去瓤,隨機(jī)抽取果塊40塊,放入滅菌瓶中,快速搗碎取汁100mL,在80°C水浴處理10min[6],10mL處理哈密瓜汁接種到增菌培養(yǎng)基(AAM)中,37°C搖床培養(yǎng)24h,1mL涂布平板接種到AAM培養(yǎng)基中,45°C培養(yǎng)2～5d,挑取單菌落連續(xù)劃線培養(yǎng),顯微鏡鏡檢,純的單菌落,通過(guò)革蘭氏染色,芽胞形態(tài)鑒定,菌株命名為B-1,s-4,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌落形態(tài)和革蘭氏染色,生理生化特征,生長(zhǎng)的溫度和p H范圍生理

生化的特征實(shí)驗(yàn):接觸酶試驗(yàn),淀粉水解試驗(yàn)、明膠水解、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽的利用、酒石酸鹽的利用。

生長(zhǎng)p H值范圍:NA培養(yǎng)基的p H值用1%的稀硫酸,1%的氫氧化鈉溶液調(diào)整到3,4,5,6,7,8,9,10,粗側(cè)得到大致范圍,再精確到0.1測(cè)定準(zhǔn)確范圍和最適p H范圍。

生長(zhǎng)溫度范圍:菌株B-1,s-4接種到p H7.0的NA培養(yǎng)基平板上,在20,30,40,50,60,70°C不同溫度培養(yǎng)粗側(cè)大致范圍,再精確到1°C測(cè)定準(zhǔn)確溫度范圍和最適的溫度范圍。

1.5 通過(guò)細(xì)菌16SrDNA鑒定

DNA提取和 PCR擴(kuò)增根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[7]。細(xì)菌擴(kuò)增引物27f 5-A GA GTT TGA TCM TGG CTC A G-3對(duì)應(yīng)于 E.coli 16SrDNA的8～27位和1492r 5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′,對(duì)應(yīng)于 E.coli 16SrDNA 的 1,525～1,542位進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增片段大約為1500bp。50μL 16SrDNA-PCR的反應(yīng)體系為:1×的 Taq Buffer 5μL,dNTP 200μmol/L,1U Taq 酶 0.3μL,0.4μmol/L 的引物 1μL,模板 DNA 50～100ng,2mmol/L MgCl24μL,使用超純水將反應(yīng)體系補(bǔ)至50μL。熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為:預(yù)變性95℃4min;94℃變性1min,55℃復(fù)性1min,72延伸 2min,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸 7min。取 3～5μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)成像。

DNA電泳檢測(cè) 用1%瓊脂糖凝膠(含核酸染液),每孔點(diǎn)樣 6μL(5μl 樣 +1μLloadingbutter),100V電泳/小時(shí)。

PCR產(chǎn)物通過(guò)切膠純化,樣品送至上海生工公司雙向測(cè)序,將拼接后的測(cè)序結(jié)果http://www.ncbi.nlm.nih.gov/,通過(guò)互聯(lián)網(wǎng),將測(cè)得的基因序列,通過(guò)Blast程序與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性較高的相關(guān)菌株的16S r RNA基因序列做最大同源性分析,并利用Mega 4.1軟件以 N-J法(neighborjoining)作系統(tǒng)樹(shù),并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定菌株的分類地位。

1.6 超高壓殺菌

1.6.1 枯草芽孢桿菌菌懸液的制備 將已分離鑒定的枯草芽孢桿菌接種到NA平板上,為了保證其營(yíng)養(yǎng)體與芽孢比例穩(wěn)定,將其在37℃培養(yǎng)48h,營(yíng)養(yǎng)體與芽孢之比大約為1∶1。用移液槍吸取2～3mL無(wú)菌生理鹽水于培養(yǎng)皿中,再用無(wú)菌棒輕輕刮下菌落,收集內(nèi)容物到無(wú)菌試管中震蕩,于4000G下離心10min后棄去上清液,菌體重新懸浮一定量的生理鹽水中?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn),100mL枯草芽孢桿菌菌液,接種到1000mL滅菌哈密瓜汁中(哈密瓜汁:121°C滅菌15 min,4°C保存?zhèn)溆?,混合均勻,使得哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌初始菌濃度為6.25×108CFU/mL。

1.6.2 超高壓殺菌實(shí)驗(yàn) 將待處理樣品封裝于無(wú)菌聚乙烯袋內(nèi),抽真空包裝,置于高壓容器內(nèi),進(jìn)行超高壓殺菌試驗(yàn)。處理溫度為35℃、45℃、55℃;保壓時(shí)間為 5min、10min、15min、20min;處理壓力100MPa、200MPa、300MPa、400MPa、500MPa,以上每個(gè)處理設(shè)有2個(gè)重復(fù),在無(wú)菌操作條件下,按《食品微生物檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》(GB4789～2003),采用平板傾注計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋超高壓處理前后樣品,在NA培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)48h后,菌落記數(shù)。每一樣品不同濃度做三個(gè)平行,選取菌落數(shù)在30～300之間計(jì)數(shù)。結(jié)果采用菌落降低對(duì)數(shù) Y=-logN/N0(N0為處理后每毫米存活菌落數(shù),N0為初始菌濃度)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的耐熱芽胞菌

根據(jù)菌落形態(tài)(圖1)、革蘭氏染色(圖2、圖3)及生理生化的鑒定結(jié)果(表1),判定分離鑒定的2株菌都屬于革蘭氏陽(yáng)性芽胞菌,需氧菌,且其菌株生長(zhǎng)p H值范圍:B-1:4.7-8.5;s-4:5.1-8.9;最適p H B-1:7.2;s-4:7.1;生長(zhǎng)溫度范圍:B-1:24-55℃;s-4:24-56℃;最適溫度B-1:37.1℃;S-4:37.2℃。

圖1 芽胞菌的菌落形態(tài)Fig.1 The colonial morphological features of Bacillus.Sp

圖2 芽胞菌營(yíng)養(yǎng)體的顯微形態(tài)(10×100)Fig.2 The vegetation micro-morphological features of Bacillus.Sp

圖3 芽胞菌芽胞的顯微形態(tài)(10×100)Fig.3 The spore micro-morphological features of Bacillus.Sp

表1 兩株菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Two strains of Physiology and chemical tests

2.2 細(xì)菌16SrDNA鑒定及序列分析

PCR產(chǎn)物純化、電泳后利用小源凝膠成像系統(tǒng)成像與Maker條帶比較,可知目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度大約為1500bp。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 哈密瓜汁芽胞菌及其系統(tǒng)發(fā)育歸屬Tab.2 Bacillus.Sp of the growth characteristics of isolated from Hami-melonjuice and their phylogenetic attribution

根據(jù)與 Genebank中已有的核酸序列比較結(jié)果,其兩株菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中同一種的細(xì)菌同源性均大于99%。

一般認(rèn)為,16SrDNA序列同源性小于98%,可以認(rèn)為屬于不同的種,同源性小于93%～95%,可以認(rèn)為屬于不同屬[8]。因此,s-4,B-1可以確定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),將B-1、s-4菌株序列和應(yīng)用Blast檢索到的與之有較高的同源性菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定菌株的分類地位。

圖4 新鮮哈密瓜汁中分離菌株序列系統(tǒng)發(fā)育分析(NJ)Fig.4 Neighbor-joing tree constructed showing the phylogenetic relationships among 16SrRNA gene sequences of isolated from Hami-melon juice.The scale bar represent 0.5 substitution.

2.3 超高壓對(duì)哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌的殺滅效果

2.3.1 一定保壓時(shí)間,壓力與溫度對(duì)哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌的殺滅效果

在處理溫度為35℃,45℃,55℃下,哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌初菌濃度為 6.25×108,壓力為100MPa,200MPa,300MPa,400MPa,500MPa,經(jīng)超高壓處理5min,15min,結(jié)果如圖2,圖3所示。

由圖5可知,哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌在處理壓力為100MPa到400M Pa,菌落降低對(duì)數(shù)隨壓力的增加而增大,100MPa至300MPa菌落降低速率較大,此時(shí)說(shuō)明大量的不耐壓營(yíng)養(yǎng)體快速死亡;300MPa至500MPa降低速度均趨于平緩,這是可能因?yàn)檠挎邨U菌自身的耐壓閾值高,壓力的增加只有少數(shù)的芽孢死亡。由圖6可知,45℃,300MPa,菌落對(duì)數(shù)最大降低為5.25個(gè)對(duì)數(shù),而500MPa菌落降低對(duì)數(shù)稍有減少,這可能與芽胞的結(jié)構(gòu)有關(guān),芽胞耐熱耐壓,壓力過(guò)高,芽胞可能處于休眠狀態(tài),對(duì)壓力有一定的抵抗力,而不易被殺死。在適當(dāng)?shù)膲毫?00MPa至400MPa,適當(dāng)?shù)臏囟瓤赡艽龠M(jìn)芽胞萌發(fā),生成的營(yíng)養(yǎng)體,在保壓時(shí)間延長(zhǎng)時(shí)即可被殺死。因此實(shí)驗(yàn)壓力選擇300MPa為處理?xiàng)l件。

圖5 保壓5min,菌落降低對(duì)數(shù)(-logN/N0)與壓力的關(guān)系Fig.5 The relation of the loss of log colony and pressure(pressure-holding 5min)

圖6 保壓15min,菌落降低對(duì)數(shù)(-logN/N0)與壓力的關(guān)系Fig.6 The relation of the lossof log colony and pressure(pressure-holding 15min)

2.3.2 一定壓力,保壓時(shí)間與溫度對(duì)哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌的殺滅效果

在處理溫度為35℃,45℃,55℃,哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌初菌濃度為6.25×108,300M Pa,保壓時(shí)間為 5～20min,結(jié)果如圖 7。由圖 7可知,300MPa處理壓力下,保壓時(shí)間5min至10min,菌落降低對(duì)數(shù)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,35℃,處理時(shí)間10min至20min,菌落降低對(duì)數(shù)隨時(shí)間增加變化不大;55℃,處理時(shí)間5min至20min,菌落降低對(duì)數(shù)呈直線上升趨勢(shì),最大可降低5.56個(gè)對(duì)數(shù);45℃時(shí),處理時(shí)間為15min能有效的殺死枯草芽孢桿菌。300MPa下,溫度越高殺菌效果越好。

綜合圖5、圖6和圖7,并結(jié)合哈密瓜熱敏性果汁的特點(diǎn)及超高壓對(duì)哈密瓜汁中Vc能保留最大含量、色澤和香氣成分影響較小的條件,得出45℃、300MPa、保壓時(shí)間15min能使哈密瓜汁中的枯草芽孢桿菌降低5.23個(gè)對(duì)數(shù)。

圖7 壓力300MPa,菌落降低對(duì)數(shù)與保壓時(shí)間的關(guān)系Fig.7 The relation between the loss of log colony and pressure-holding time(300MPa)

3 結(jié)論

從新鮮哈密瓜汁中分離兩株菌,形態(tài)特征及分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果均表明這2株都是枯草芽孢桿菌。

超高壓協(xié)同中溫處理對(duì)哈密瓜汁中枯草芽孢桿菌有很好的殺滅效果,尤其是結(jié)合哈密瓜汁熱敏性特點(diǎn)及超高壓對(duì)哈密瓜汁品質(zhì)中Vc、色澤、香氣成分的影響,得出300MPa、45℃、處理時(shí)間15min的處理?xiàng)l件為實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)參數(shù)。

[1]趙紹雙.淺談哈密瓜歷史淵源[J].新疆地方志,2001,3:40-42.

[2]邱偉芬,江漢湖.食品超高壓殺菌技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2001,22(5):81-84.

[3]丁 林.超高壓食品滅菌技術(shù)[J].中國(guó)食品,2000,(9):33.

[4]祝恒信.超高壓技術(shù)在食品工業(yè)的研究與應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào),1995,9(3):69-73.

[5]鄭伯雄,吳 宏,李冀新.哈密瓜汁加工工藝[J].食品科學(xué),1991,(11):20-22.

[6]Spilimbergo S,Lauro F M,Bertucco A,Bertoloni G.Inactivation of Bacillus subtilis spores by supercritical CO2treatment[J].Innovative Food Science and Emerging Technologies,2003,(4):161-165

[7]東秀珠,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1999,399-405.

[8]Delong E F,Wickham G S,Pace N R.Phylogenetic stains:Ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells[J].Science,1982,243:1360-1363.

A Research into the Lethal Effect of Bacillus sp.Isolated and Identified from Fresh Hami Melon Juice with high Hydrostatic Pressure Treatment

JIANG Hairong,YIN Linlin,SONG Lijun,YU Xiaoyan,CHEN Jiluan
(Food College,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Fresh Hami-melon juice was used as test material in this study to isolate the Bacillus subtilis.After the traditional identification of morphological features investigation,the 16SrDNA sequences were performed by employing the universal prime bacterial for polymerase chain reaction(PCR)amplification.The alignment search was performed with BLAST and GenBank databases.Compared the software of Clastal1.81,the phylogenetic tree was built using Mega 4.1 sof tware.From the phylogenetic tree,it can be seen that Bacillus subtilis is main cultivated bacteria in the f resh hami melon juice.The effect of high hydrostatic pressure treatment(100～500MPa)and relative low temperature(35～55℃)treatment at various process times(10～20min)on reduction of Bacillus subtilis,which suspended in Hami-melon juice was investigated.It was shown that the best parameters to sterilize Bacillus subtilis in Hami-melon juice and combine to hold maximum vc、original color and flavor of Hami-melon juice were temperature,45 ℃;pressure,300MPa;treatment time,15min to reduce 5.23 log.

Bacillus sp;isolate and identif y;high hydrostatic pressure treatment;fresh Hami-melon juice

Q939.1;S652.1;S436.5

A

1007-7383(2010)01-0091-05

2009-10-17

教育部重點(diǎn)課題(207137),兵團(tuán)博士基金項(xiàng)目(2007jc11)

姜海榮(1982-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

陳計(jì)巒(1973-),女,副教授,主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方向研究;e-mail:chenjiluan@163.com。