低氧和運(yùn)動(dòng)經(jīng)AR-IGF-1對骨骼肌蛋白質(zhì)合成的作用

葉鳴，賀道遠(yuǎn)，劉霞，曾凡星，王煜

●成果報(bào)告Original Artic les

低氧和運(yùn)動(dòng)經(jīng)AR-IGF-1對骨骼肌蛋白質(zhì)合成的作用

葉鳴1，賀道遠(yuǎn)2，劉霞3，曾凡星4，王煜5

目的：探討低氧、運(yùn)動(dòng)對骨骼肌蛋白質(zhì)合成的作用。方法：2月齡雄性SD大鼠40只隨機(jī)分為對照組、低氧組、運(yùn)動(dòng)組、低氧運(yùn)動(dòng)組，實(shí)驗(yàn)28天后取材測試。結(jié)果：（1）運(yùn)動(dòng)組AR蛋白表達(dá)量、AR活性與骨骼肌總蛋白質(zhì)含量比對照組顯著升高；（2）低氧組骨骼肌睪酮含量、AR蛋白表達(dá)量、IGF-1mRNA含量以及肌纖維橫截面積較對照組顯著降低；AR活性、骨骼肌蛋白質(zhì)含量較對照組顯著升高；（3）低氧運(yùn)動(dòng)組AR蛋白表達(dá)量、AR活性和骨骼肌總蛋白含量比運(yùn)動(dòng)組顯著下降。結(jié)論：（1）運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行低氧暴露比單純運(yùn)動(dòng)更能通過AR含量－AR活性水平抑制蛋白質(zhì)合成；（2）低氧、運(yùn)動(dòng)或低氧運(yùn)動(dòng)通過睪酮調(diào)節(jié)AR數(shù)量及活性，最終影響骨骼肌蛋白含量；（3）低氧、運(yùn)動(dòng)或低氧運(yùn)動(dòng)可通過調(diào)節(jié)AR轉(zhuǎn)錄活性影響IGF-1mRNA表達(dá)，最終調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)合成。

低氧運(yùn)動(dòng)；AR表達(dá)；AR與DNA結(jié)合能力；IGF-1mRNA

高住低訓(xùn)（Living high－training low HiLo）是美國學(xué)者萊文在高原訓(xùn)練基礎(chǔ)上提出的一種低氧訓(xùn)練模式，主要用于耐力項(xiàng)目運(yùn)動(dòng)員提高有氧運(yùn)動(dòng)能力。高住低訓(xùn)期間運(yùn)動(dòng)員白天進(jìn)行耐力訓(xùn)練，肌肉蛋白質(zhì)分解增加，合成減少，存在蛋白質(zhì)凈降解現(xiàn)象，耐力運(yùn)動(dòng)后蛋白質(zhì)以合成代謝為主，蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)的趨勢一直持續(xù)到第二天訓(xùn)練之前[1-2]。高住低訓(xùn)是否可以避免低氧對骨骼肌的負(fù)面作用？運(yùn)動(dòng)員白天進(jìn)行耐力訓(xùn)練后，晚上在低氧環(huán)境中休息是否抑制骨骼肌蛋白質(zhì)合成？這些都直接關(guān)系到運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練后的恢復(fù)、運(yùn)動(dòng)員力量、速度素質(zhì)的保持或提高，所以為了全面完整地把握高住低訓(xùn)對機(jī)體作用的規(guī)律，高住低訓(xùn)，尤其是高住低氧對蛋白質(zhì)合成的影響是一個(gè)急待探討的問題。因?qū)\(yùn)動(dòng)員實(shí)施肌肉活檢很困難，所以本研究以大鼠為研究對象，利

用一個(gè)促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的耐力運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練模型，模擬高住低訓(xùn)，觀察低氧、低氧運(yùn)動(dòng)是否通過骨骼肌睪酮含量影響雄激素受體含量及其活性，調(diào)節(jié)雄激素受體的靶基因-IGF-1mRNA，最終影響耐力運(yùn)動(dòng)后骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，試圖為高住低訓(xùn)期間運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力和肌肉力量保持和提高提供理論依據(jù)。國內(nèi)外未見高住低訓(xùn)從AR表達(dá)、AR轉(zhuǎn)錄激活活性和IGF-1mRNA等方面對骨骼肌蛋白質(zhì)合成作用及其機(jī)理的研究報(bào)道。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象與分組

健康雄性、2月齡SD大鼠40只，體重（180～200）g，隨機(jī)分為4組：對照組、低氧組、運(yùn)動(dòng)組、低氧運(yùn)動(dòng)組，每組各10只。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部SPF級動(dòng)物房中飼養(yǎng)，溫度22～26℃，濕度30%～58%，自由進(jìn)食及飲水。

1.2 測試樣本采集與組織準(zhǔn)備

第28天各組動(dòng)物出低氧帳篷后分別用25%烏拉坦麻醉后腹主動(dòng)脈取血處死，常規(guī)制備血清，置于-80℃冰箱保存?？焖偃〕鐾炔康碾枘c肌，剔除脂肪和筋膜，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱重，投入液氮中保存。

用于形態(tài)學(xué)測定的肌肉塊被切成4×4×6mm3大小，自然伸直（勿牽拉），用OCT（SAKURA，O．C．T．Compound）包裹后，投入用液氮預(yù)冷的裝有異戊烷（-70℃）的小燒杯中速凍約40 s，之后迅速用錫紙包好標(biāo)記放入液氮中，取出后用封口袋密封后于-80℃長期保存，用于冰凍切片。

用于勻漿的肌肉樣品，被切成重約100mg大小。用錫紙包好、標(biāo)記后放入液氮中，于-80℃長期保存。

1.3 指標(biāo)測試方法

1.3.1 骨骼肌睪酮含量稱取40mg的腓腸肌，用眼科小剪迅速剪碎，按1：4的比例加入組織勻漿介質(zhì)，勻漿20 s*3次，勻漿速度為13 000 rpm，然后4℃，20 000 r/min離心20min，取上清于-80℃儲存待測。

采用北京華英HY-020睪酮放免試劑盒，取標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行加樣，利用GC-911-r計(jì)數(shù)儀直接讀出樣品濃度。

1.3.2 骨骼肌AR蛋白表達(dá)取40mg骨骼肌組織，以1：4的比例加入細(xì)胞裂解緩沖液，冰浴勻漿，測定蛋白濃度。上樣量40 ug/well，濃縮膠60V，1．5 h，分離膠90V，2．5 h，電泳。Janssen Life Sciences Products半干式電轉(zhuǎn)印儀350mA轉(zhuǎn)膜1．5 h。封閉過夜后，與稀釋1∶500的抗體（AR（N-20）sc-816：Santa Cruz Biotechnology）4mL結(jié)合，4℃過夜。與稀釋1∶3 000的二抗（Anti-Rabbit IgG/HRP：Dakocytomation）4m L結(jié)合，室溫震蕩孵育1 h。利用ECL顯色試劑盒和ImageQuantECL凝膠成像儀曝光，采集并分析圖像。

1.3.3 骨骼肌組織中AR與DNA結(jié)合能力稱取肌肉組織40 mg，利用美國Pierce公司NE-PER核蛋白抽提試劑盒制備核蛋白抽提物?？捡R斯亮藍(lán)法進(jìn)行核蛋白定量。采用特異性的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)來證實(shí)探針的特異性，探針序列（5'-atagtccatgatgttctcaagat-3'，5'-atcttgagaacatcatggactat-3'），利用AR（N-20）sc-816（Santa Cruz Biotechnology）進(jìn)行超級凝膠電泳實(shí)驗(yàn)確定結(jié)合復(fù)合物中AR蛋白的特異性。凝膠電泳遷移率改變分析實(shí)驗(yàn)（EMSA）：采用美國Pierce公司LightShift ChemiluminescentEMSA試劑盒和TL－2000紫外交聯(lián)儀進(jìn)行核蛋白與探針結(jié)合，電泳，顯影。利用LAS－3000化學(xué)發(fā)光及成像系統(tǒng)成像，采集信號。用Molecular Imager FXSystem軟件系統(tǒng)對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.3.4 骨骼肌IGF-1mRNA表達(dá)首先以TrizolTM提取總RNA，使用Farmentas K1622試劑盒，按說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。使用taq酶（TakaRa DR001A）試劑盒，按說明在PCR儀（GeneAmpPCRSystem9700）進(jìn)行擴(kuò)增。IGF-1基因的引物序列（5'-AAGCCTACAAAGTCAGCTCG-3'，5'-GGTCTTGTTTCCTGCACTTC-3'；NM 178866．2），擴(kuò)增條件為：94℃5min；94℃30 sec，58℃30 sec，72℃45 sec，32循環(huán)；72℃10min。取10 uLPCR產(chǎn)物，1．5%瓊脂糖、100V恒壓電泳30m in，凝膠紫外數(shù)字成像系統(tǒng)（LISCAPcaptureapplication軟件）拍照，圖像條帶光密度分析處理。1.3.5骨骼肌總蛋白質(zhì)含量采用BCA測試方法，按PIERCE公司BCA蛋白測試試劑盒說明進(jìn)行測試。

1.3.6 冰凍切片和HE染色冰凍切片：將肌肉樣品從-80℃冰箱中取出放入恒冷冰凍切片機(jī)（LEIKA CM1900）內(nèi)，在-20℃平衡30min后切厚為8 um切片，然后貼于涂有APES載玻片上，晾干后，冷丙酮固定10min，PBS洗3次，存于-20℃，用于HE染色。HE染色：常規(guī)HE染色。顯微觀察、肌纖維橫截面積測量：HE染色封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍片。IPP 6．0軟件測量面積，每片選取4個(gè)視野計(jì)算面積平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Spss13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較用單因素方差分析。P＜0．05為顯著性差異，P＜0．01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧、運(yùn)動(dòng)對骨骼肌睪酮含量及AR蛋白表達(dá)的影響

由表2所示，低氧組AR表達(dá)比運(yùn)動(dòng)組明顯下降，說明低氧抑制AR蛋白水平。Ghafaretal的研究報(bào)道說明了LNCaP細(xì)胞在24 h持續(xù)低氧暴露和24 h低氧暴露后復(fù)氧均降低AR蛋白水平和AR靶基因PSA水平[3]。推測低氧應(yīng)激一方面抑制AR蛋白翻譯，抑制AR蛋白質(zhì)合成，一方面降低AR蛋白的穩(wěn)定性，增加AR蛋白的降解，所以在低氧作用下AR蛋白水平是降低的。低氧運(yùn)動(dòng)組的AR蛋白表達(dá)介于低氧組和運(yùn)動(dòng)組之間，結(jié)合運(yùn)動(dòng)組的變化，說明低氧運(yùn)動(dòng)組AR蛋白表達(dá)明顯減低是低氧抑制效應(yīng)起了主要作用。

表2 各組指標(biāo)測試結(jié)果Tab.2 The testing results of several index between groups

各組骨骼肌睪酮、AR蛋白水平與腓腸肌總蛋白含量的變化一致，說明睪酮是通過AR調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，AR蛋白水平的變化更能反映骨骼肌蛋白質(zhì)含量的變化。低氧暴露、運(yùn)動(dòng)或低氧運(yùn)動(dòng)均通過改變骨骼肌睪酮水平來調(diào)節(jié)AR蛋白水平改變，最終影響骨骼肌蛋白質(zhì)含量。

2.2 低氧、運(yùn)動(dòng)對骨骼肌AR轉(zhuǎn)錄活性的影響

雄激素受體是一種配體依賴的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞核內(nèi)與DNA上特定的ARE結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)，AR與DNA結(jié)合能力反應(yīng)了AR核轉(zhuǎn)錄因子的活性。

如表2所示，運(yùn)動(dòng)組AR與DNA結(jié)合能力明顯提高，結(jié)合運(yùn)動(dòng)組AR蛋白水平升高，說明運(yùn)動(dòng)不僅通過改變AR含量，還可通過提高AR活性來調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)的合成。近年來的研究證明運(yùn)動(dòng)可以通過MAPK途徑影響AR活性。與運(yùn)動(dòng)相關(guān)聯(lián)的生長因子、細(xì)胞因子、缺氧、胞內(nèi)鈣離子的變化和機(jī)械應(yīng)力等都可以刺激MAPK信號級聯(lián)。許多學(xué)者的研究從MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑探討骨骼肌對運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)機(jī)制：有學(xué)者的研究顯示運(yùn)動(dòng)使骨骼肌中p38MAPK和JNK一次性升高，尤其是p38MAPKγ的活性明顯升高[4]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)都表明一過性的耐力和力量訓(xùn)練后，骨骼肌細(xì)胞p38MAPK分子被激活[5-6]；也有研究表明8周的耐力訓(xùn)練使骨骼肌發(fā)生適應(yīng)性改變的同時(shí)，骨骼肌中p38MAPK活性明顯增高[7]。

低氧組和低氧運(yùn)動(dòng)組AR與DNA結(jié)合能力均略高于對照組，但沒有顯著性差異變化。Soo-Yeon Park[8]等人的研究觀察了LNCaP細(xì)胞在低氧環(huán)境中暴露4 h后復(fù)氧0、2、6、24 h的AR與ARE結(jié)合活性的變化。結(jié)果顯示4 h低氧（氧濃度低于0.05%）處理后，LNCaP細(xì)胞中AR與ARE結(jié)合活性明顯提高，在復(fù)氧2h時(shí)達(dá)到最大，然后隨時(shí)間的推移逐漸下降。細(xì)胞被暴露8或16 h低氧后復(fù)氧2 h，觀察AR的刺激作用小于低氧處理4 h后所看到的最大AR刺激作用。同時(shí)還用Western blot和ELISA assay分析觀察4 h低氧處理后的復(fù)氧期間，細(xì)胞培養(yǎng)基中PSAmRNA水平、細(xì)胞PSA蛋白和PSA分泌明顯增加。并且還發(fā)現(xiàn)低氧作用于轉(zhuǎn)染了ARE-熒光素酶報(bào)告基因的LNCaP細(xì)胞后，熒光素酶活性明顯提高了。以上兩部分研究說明低氧提高了AR的轉(zhuǎn)錄激活作用，而且不只限于PSA基因。同時(shí)在低氧處理4、8、16 h后復(fù)氧24 h沒有觀察到AR蛋白水平的任何變化，說明低氧可促進(jìn)AR的轉(zhuǎn)錄激活作用，但并不改變AR的含量。為了進(jìn)一步證實(shí)短暫低氧對AR轉(zhuǎn)錄激活作用不僅是在LNCaP細(xì)胞，同時(shí)又利用人類缺乏AR的DU145前列腺癌細(xì)胞，把外源的野生型AR和ARE-熒光素酶一起引入到DU145細(xì)胞，進(jìn)行4 h低氧暴露后發(fā)現(xiàn)：與LNCaP細(xì)胞一致，短暫的低氧暴露激活外源性AR的轉(zhuǎn)錄活性，并提高了ARE－熒光素酶的活性，在低氧處理4h后同樣觀察到低氧對AR的最大刺激作用。總而言之，以上研究結(jié)果說明：低氧、復(fù)氧的動(dòng)態(tài)變化提高了AR-ARE結(jié)合能力和AR靶基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示在雄激素衰竭的培養(yǎng)基中低氧誘導(dǎo)的AR-ARE結(jié)合活性完全停止，說明低氧提高AR轉(zhuǎn)錄激活是依賴雄激素的，雄激素結(jié)合雄激素受體是AR轉(zhuǎn)錄激活作用所必需的。低氧可提高AR對低雄激素水平的敏感性，建議在雄激素低于生理水平時(shí)，低氧明顯刺激AR的轉(zhuǎn)錄激活活性。

Ghafar etal的研究卻報(bào)道了在進(jìn)行24 h持續(xù)低氧暴露后或24 h低氧后復(fù)氧，LNCaP細(xì)胞中PSA和AR蛋白水平均明顯降低。作者分析低氧提高AR功能的分子機(jī)理在于低氧激活ROS，活化的ROS經(jīng)由PTK蛋白酪氨酸激酶刺激PI3K和 MAPK途徑，激活的MAPK信號途徑可明顯提高AR的轉(zhuǎn)錄激活活性，低氧產(chǎn)生的ROS可能直接修飾AR的氧化－還原敏感區(qū)域，低氧調(diào)節(jié)共激活因子和抑制因子之間的平衡變化可能也影響AR激活。

本研究中未見單純低氧暴露或運(yùn)動(dòng)后低氧暴露比對照組明顯提高AR的轉(zhuǎn)錄活性，分析原因可能是低氧刺激的濃度較高，機(jī)體對低氧逐漸適應(yīng)的結(jié)果。盡管很多研究建議可能通過不依賴雄激素的途徑激活A(yù)R促轉(zhuǎn)錄活性，但本實(shí)驗(yàn)通過觀察各組骨骼肌睪酮含量、AR表達(dá)和AR活性的變化，證實(shí)了AR的轉(zhuǎn)錄激活是依賴雄激素的。

雖然低氧組和高住低訓(xùn)組睪酮水平明顯降低，但AR蛋白水平和AR活性比對照組都沒有顯著性差異的變化，因此可以解釋低氧組和高住低訓(xùn)組骨骼肌總蛋白含量相對于對照組沒有明顯變化。

2.3 低氧、運(yùn)動(dòng)對骨骼肌IGF-1m RNA的影響

IGF-1對肌肉組織的生長起調(diào)控作用，表現(xiàn)為增加肌肉蛋白質(zhì)合成，在細(xì)胞整體水平上對細(xì)胞的增殖、分裂、生長、以及凋亡的生理過程發(fā)生影響。骨骼肌組織以自分泌或旁分泌的方式自身分泌產(chǎn)生IGF-1。

有少量耐力運(yùn)動(dòng)對IGF-1影響的報(bào)道。大鼠12周跑臺運(yùn)動(dòng)后骨骼肌IGF-1和睪酮受體mRNA水平?jīng)]有變化，而血中IGF-1和睪酮水平顯著降低[9]。Eliakim報(bào)道5天耐力運(yùn)動(dòng)后肌肉IGF-1蛋白增加而基因表達(dá)沒有變化[10]。

由表2所示，運(yùn)動(dòng)組IGF-1mRNA表達(dá)與對照組相比沒有顯著變化，本研究結(jié)果與已有的研究一致。分析認(rèn)為長時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)后機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)，加上耐力運(yùn)動(dòng)本身的牽拉作用不如力量運(yùn)動(dòng)時(shí)明顯，可能導(dǎo)致對IGF-1分泌影響不大。耐力運(yùn)動(dòng)主要是改善肌肉供血與供氧，肌纖維的牽拉刺激不明顯，IGF-1自分泌/旁分泌不顯著。

由表2所示，低氧組IGF-1mRNA表達(dá)明顯下降，低氧運(yùn)動(dòng)組IGF-1mRNA表達(dá)無顯著變化。低氧及低氧運(yùn)動(dòng)對IGF-1的影響報(bào)道極少，Moromisato發(fā)現(xiàn)低氧增加IGF-1mRNA且具有組織特異性[11]。有報(bào)道低氧時(shí)GH/IGF-1軸受到抑制[12]，至于肌肉組織如何應(yīng)對這一反應(yīng)，是否與GH/IGF-1軸受到抑制有關(guān)還不清楚。還有研究顯示低氧運(yùn)動(dòng)后血GH迅速升高，但這種升高并沒有導(dǎo)致肝及血中的IGF-1的響應(yīng)升高[13]。

AR轉(zhuǎn)錄活性通常需要用AR與DNA結(jié)合能力和AR靶基因mRNA水平的高低來共同反映。在骨骼肌中，IGF-1是主要的促合成因子，通過PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)合成。IGF-1是AR的靶基因，近年來很多研究相繼證明睪酮促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的機(jī)理是睪酮通過AR激活I(lǐng)GF-1。Urban etal的研究顯示對性腺機(jī)能減退的老年男性補(bǔ)充外源性睪酮可提高肌肉蛋白質(zhì)合成和肌肉力量，同時(shí)伴有肌肉中IGF-1 mRNA升高[14]。睪酮通過AR使IGF-1mRNA升高可能是提高肌肉蛋白質(zhì)合成必需的[15]，相反雄激素減少的青年肌肉中IGF-1mRNA減少，導(dǎo)致肌肉萎縮[16]，AR、IGF-1mRNA增加與肌肉增加明顯相關(guān)[17]。睪酮治療可使閹羊肌肉局部產(chǎn)生IGF-1增多，而IGF-1增加與肌肉重量增加明顯相關(guān)[18]。

近年來還有一些研究提示：雄激素不僅通過AR促進(jìn)IGF-1的轉(zhuǎn)錄激活，還會促進(jìn)IGF-IR的轉(zhuǎn)錄激活。在前列腺上皮細(xì)胞，雄激素可能是通過激活細(xì)胞質(zhì)中Src-Raf-Ras-Map激酶途徑，激活ERK1/2，通過AR提高IGF-IR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[19]，促進(jìn)IGF-IR升高。除此之外，雄激素還可能刺激KFL6增加，KFL6通過與IGF-IR啟動(dòng)子結(jié)合提高IGF-IR的表達(dá)[20]。盡管還存在很多爭議，但這些研究一致顯示雄激素是通過AR提高IGF-IR的蛋白表達(dá)，同時(shí)提高IGF-IR磷酸化水平，IGF-IR的變化提高IGF-1的細(xì)胞增殖反應(yīng)。這種機(jī)理是否存在于骨骼肌細(xì)胞還有待進(jìn)一步研究。

綜合AR與DNA結(jié)合能力和IGF-1mRNA的變化，說明低氧、運(yùn)動(dòng)、低氧運(yùn)動(dòng)可通過調(diào)節(jié)AR轉(zhuǎn)錄活性影響骨骼肌中IGF-1mRNA的表達(dá)，通過IGF-1途徑最終調(diào)節(jié)骨骼肌的蛋白質(zhì)合成。

2.4 低氧、運(yùn)動(dòng)對骨骼肌蛋白質(zhì)總量的影響

如表2所示，運(yùn)動(dòng)組大鼠骨骼肌總蛋白質(zhì)含量明顯升高反映了機(jī)體對28天耐力運(yùn)動(dòng)的良好適應(yīng)，說明本實(shí)驗(yàn)采用的運(yùn)動(dòng)模型有效促進(jìn)肌肉蛋白質(zhì)的合成代謝，在此模型基礎(chǔ)上進(jìn)行低氧暴露模擬高住低訓(xùn)是可行的。低氧組比對照組略高，說明單純的間斷性低氧暴露對蛋白質(zhì)含量影響不大。28天低氧運(yùn)動(dòng)組的骨骼肌總蛋白含量最低，與運(yùn)動(dòng)組比較，說明每天運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行低氧暴露還是在一定程度上抑制了蛋白質(zhì)的合成。

運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行低氧暴露降低骨骼肌總蛋白質(zhì)含量的原因可能是：低氧抑制蛋白質(zhì)合成、加快蛋白質(zhì)分解，其中主要是抑制蛋白質(zhì)合成，可能主要是由于促合成激素的變化或缺氧直接抑制了蛋白質(zhì)的合成。

低氧暴露可能抑制睪酮合成：長期低氧暴露抑制下丘腦－垂體－性腺軸，抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)睪酮合成酶的活性，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素分泌，糖皮質(zhì)激素在下丘腦－垂體－睪丸三個(gè)環(huán)節(jié)影響睪酮的分泌。除了雄激素之外，蛋白質(zhì)合成代謝還受生長激素、胰導(dǎo)素等激素通過PI3K、MAPK途徑調(diào)節(jié)。有學(xué)者報(bào)道了2 km和5 km的慢性連續(xù)低氧激活SS，顯著抑制GH-IGF-1軸，這種抑制作用一直持續(xù)整個(gè)低氧過程[12]。結(jié)合本研究同期實(shí)驗(yàn)28天低氧運(yùn)動(dòng)組胰島素的變化，說明低氧、低氧運(yùn)動(dòng)使蛋白質(zhì)含量比對照組、運(yùn)動(dòng)組減低的另一可能機(jī)理是低氧降低血清中胰島素水平。

Sandrine等人報(bào)道了低氧直接抑制蛋白質(zhì)合成：大鼠肝細(xì)胞在5%氧濃度的低氧環(huán)境中孵育120min后，細(xì)胞內(nèi)ATP、RNA和蛋白質(zhì)合成分別明顯降低了62%、82%和93%[21]。Victor R等人測試了大鼠體內(nèi)心肌、骨骼肌、肝臟、脛骨、皮膚、大腦、腎、肺等各種組織在10%氧濃度中低氧暴露6 h后，蛋白質(zhì)合成速率降低了15%～35%[22]。近幾年關(guān)于低氧直接抑制蛋白質(zhì)合成的機(jī)理主要集中在蛋白質(zhì)的翻譯環(huán)節(jié)：低氧通過抑制mRNA翻譯的起始步驟而快速抑制蛋白質(zhì)的合成，低氧抑制翻譯是通過兩個(gè)不同的機(jī)理介導(dǎo)的[23]：第一個(gè)是通過磷酸化并抑制真核起始因子eIF2α，PERK激酶可磷酸化這個(gè)因子；低氧抑制翻譯的第二個(gè)機(jī)理是使第二個(gè)真核起始復(fù)合物eIF4F失活。低氧很快并且持續(xù)的抑制了mRNA翻譯，在1 h急性低氧暴露后蛋白質(zhì)合成速率降低了60%～70%，隨后復(fù)氧可使蛋白質(zhì)合成很快恢復(fù)到常氧水平[24]。低氧使蛋白質(zhì)合成減少并不是通過HIF途徑，而是通過氧傳感途徑直接抑制mRNA翻譯的起始步驟[25]，低氧通過抑制mTOR途徑的4E-BP1和eEF2降低乳腺上皮細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成[26]。

2.5 低氧、運(yùn)動(dòng)對骨骼肌肌纖維橫截面積的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)28天低氧運(yùn)動(dòng)后肌纖維面積有減小的趨勢（比對照少7%），低氧暴露后肌肉萎縮肌纖維面積減少14%。在一些研究中也發(fā)現(xiàn)了低氧暴露及低氧運(yùn)動(dòng)對肌肉體積的影響，Hoppeler[27]發(fā)現(xiàn)人體在慢性低氧暴露后肌肉萎縮，肌肉橫截面積下降10%。Sillau[28]等人以大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)慢性缺氧時(shí)骨骼肌纖維萎縮、變細(xì)，毛細(xì)血管密度增加。間歇性低氧運(yùn)動(dòng)對肌肉體積的影響報(bào)道不多。我們采用的是運(yùn)動(dòng)后1 h即進(jìn)入低氧艙進(jìn)行低氧暴露，可能運(yùn)動(dòng)后低氧狀態(tài)下機(jī)體的恢復(fù)不充分，影響肌肉生長，肌纖維面積有減少趨勢。

肌肉在低氧暴露及低氧運(yùn)動(dòng)后適度萎縮是低氧和運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的結(jié)果。機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)氧供應(yīng)減少，為了適應(yīng)這一環(huán)境的變化，機(jī)體通過肌纖維的萎縮、變細(xì)，毛細(xì)血管密度增加，使氧的彌散距離縮短，從而有利于骨骼肌組織氧的供應(yīng)，適應(yīng)低氧環(huán)境。耐力運(yùn)動(dòng)時(shí)也可能造成骨骼肌的低氧，機(jī)體或者通過增強(qiáng)心肺功能增加氧供或線粒體毛細(xì)血管增多加強(qiáng)氧利用，或者肌纖維的適度萎縮等來調(diào)整自身結(jié)構(gòu)和機(jī)能狀況從而適應(yīng)運(yùn)動(dòng)時(shí)的氧供。缺氧引起肌肉萎縮的機(jī)制不清楚，可能與缺氧時(shí)肌肉蛋白的大量分解及動(dòng)物的活動(dòng)量減少有關(guān)。

3 小結(jié)

綜上所述，與運(yùn)動(dòng)組相比，低氧運(yùn)動(dòng)組AR含量、AR活性及骨骼肌總蛋白含量均顯著降低，說明運(yùn)動(dòng)后進(jìn)行低氧暴露比單純運(yùn)動(dòng)通過AR含量－AR活性水平抑制蛋白質(zhì)合成，影響機(jī)體的恢復(fù)。綜合四組骨骼肌睪酮含量、AR蛋白水平、AR活性、骨骼肌蛋白含量的變化，說明低氧、運(yùn)動(dòng)或低氧運(yùn)動(dòng)通過睪酮調(diào)節(jié)AR數(shù)量及活性，最終影響骨骼肌蛋白含量。綜合四組AR與DNA結(jié)合能力和IGF-1mRNA的變化，說明低氧、運(yùn)動(dòng)或低氧運(yùn)動(dòng)可通過調(diào)節(jié)AR轉(zhuǎn)錄活性影響骨骼肌中IGF-1mRNA的表達(dá)，通過IGF-1途徑最終調(diào)節(jié)骨骼肌的蛋白質(zhì)合成。

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The Effect of Hypoxia and Exercise on M uscle Protein Synthesis via AR-IGF-1

YEMing1,HEDaoyuan2,LIU Xia3,ZENG Fanxing4,WANG Yu5
（1.Dept.of Exercise Physiology,Capital Institute of Physical Education,Beijing 100088,China;2.Dept.of PE,Sanxia University,Yichang 443002,China;3.Dept.of PE,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;4.Dept.of Exercise Physiology,Beijing Sport University, Beijing 100084,China;5.Dept.of Sport Anatomy,Xi’an Institute of Physical Education,Xi＇an 710068,China）

Purpose:To study the effect of hypoxia and exercise on protein synthesis in skeletalmuscle.Methods:2 monthsmale Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups as follow:control group,hypoxic group,exercise group,hypoxic exercise group.In the 28th day of test,the sampleswere tested.Results:1)Compared with control group,the exercise group's AR protein expression,AR activity and muscle total protein content increased significantly.2)Compared with control group,the hypoxic group'smuscle testosterone,AR protein expression,IGF-1mRNA and cross section area ofmuscle fiber decreased significantly,AR activity and muscle total protein content increased significantly.3)Compared with exercise group,the hypoxia exercise group's AR protein expression,AR activity and muscle total protein content decreased significantly.Conclusions:1)Hypoxia after exercise inhibited muscle protein synthesismuch via AR protein content-AR activity than normoxia exercise.2)Hypoxic exposure,normoxia exercise,hypoxia exercise regulated AR protein content and AR activity by changing muscle testosterone leval,and influenced muscle protein content finally.3)Hypoxic exposure,normoxia exercise,hypoxia exercise influenced IGF-1mRNA by regulating AR activity,and regulated muscle protein synthesis finally.

hypoxic exercise;AR expression;AR and DNA binding ability;IGF-1mRNA

G 804.23

A

1005-0000（2010）02-0125-05

2009-09-26；

2009-11-10；錄用日期：2009-11-15

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金（項(xiàng)目編號：20050043002）；北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（項(xiàng)目編號：200701）。

葉鳴（1975-），女，陜西綏德人，博士，首都體育學(xué)院副教授。通訊作者：曾凡星（1956-），男，北京體育大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，Email：fanxingz@china.com.cn。

1.首都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)生理生化教研室，北京100088；2.三峽大學(xué)體育學(xué)院，宜昌443002；3.揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院，揚(yáng)州225009；4.北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)生理教研室，北京100084；5.西安體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)解剖生物力學(xué)教研室，西安710068。

運(yùn)動(dòng)組和低氧運(yùn)動(dòng)組先進(jìn)行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練1周，然后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)4周，各組的生活、運(yùn)動(dòng)和低氧暴露方式見表1。

表1 各組大鼠生活、運(yùn)動(dòng)和低氧暴露方式一覽表
Tab.1 living，exercise，hypoxia exposuremodes ofeach groups

分組生活方式運(yùn)動(dòng)和低氧方式對照組在常氧環(huán)境下安靜生活訓(xùn)練方式：動(dòng)物跑臺耐力運(yùn)動(dòng)，跑臺坡度為5°，跑速為20m/min，持續(xù)運(yùn)動(dòng)1 h/天，6天/周，4周。低氧帳篷氧濃度：13.6%（大約3500m），4周。低氧組晚上在低氧環(huán)境下暴露12 h運(yùn)動(dòng)組白天在常氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)1 h低氧運(yùn)動(dòng)組白天在常氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)1 h，晚上在低氧環(huán)境下暴露12 h