不同培養(yǎng)條件對(duì)泗棉三號(hào)莖尖培養(yǎng)的影響

朱　姝

摘要以陸地棉“泗棉3號(hào)”為材料，研究了活性炭、植物凝膠和組培苗的嫁接對(duì)其莖尖培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：在凝固劑植物凝膠上生長(zhǎng)的莖尖狀況優(yōu)于瓊脂；活性炭顯著地促進(jìn)了莖尖成苗；嫁接顯著提高了組培苗的成活率，優(yōu)化了泗棉三號(hào)的莖尖培養(yǎng)體系。

關(guān)鍵詞泗棉3號(hào)莖尖植物凝膠

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)是世界上的主要產(chǎn)棉國(guó)家之一。隨著我國(guó)棉花育種工作的進(jìn)步，培育出來了很多適合我國(guó)栽培的品種，自二十世紀(jì)七十年代以來，以基因工程方法培育棉花新品種，如Bt抗蟲棉花的培育品種，同時(shí)還結(jié)合生理育種、雜交育種等方式獲得很多優(yōu)良品種。

莖尖培養(yǎng)在種質(zhì)資源保存、特異材料擴(kuò)繁和雜種優(yōu)勢(shì)固定中起著十分重要的作用。利用這優(yōu)點(diǎn)，可以建立莖尖分生組織和遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)合的轉(zhuǎn)化體系。棉花莖尖分生組織由分生能力很強(qiáng)的細(xì)胞組成，快速生長(zhǎng)，能夠長(zhǎng)成完整植株。利用莖尖外植體作為轉(zhuǎn)基因受體，可以避免用原生質(zhì)體、愈傷組織等作基因受體時(shí)所遇到的植株再生頻率低，再生植株后代易發(fā)生變異等障礙。

泗棉3號(hào)是江蘇泗陽(yáng)棉花原種場(chǎng)育出來的，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病等優(yōu)良特性。本文以此為材料，研究了活性炭、植物凝膠和組培苗的嫁接對(duì)其莖尖培養(yǎng)的影響，為泗棉3號(hào)的遺傳改良，種質(zhì)資源離體保存等提供技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

泗棉三號(hào)種子，購(gòu)自江蘇農(nóng)科院明天種業(yè)公司。

泗棉3號(hào)是江蘇省泗陽(yáng)棉花原種場(chǎng)采用抗病棉品系新洋76-75作母本與優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品系泗陽(yáng)791作父本進(jìn)行配組雜交選擇而育成的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病棉花品種。1993年通過江蘇省農(nóng)作物品種審定并定名。1994年通過省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。1995年被國(guó)家科委列入“國(guó)家級(jí)科技成果重點(diǎn)推廣計(jì)劃”，農(nóng)業(yè)部列入“發(fā)展棉花生產(chǎn)專項(xiàng)基金項(xiàng)目”。1996年被國(guó)家科委和農(nóng)業(yè)部聯(lián)合評(píng)定為全國(guó)“八五”期間育成的10個(gè)重大農(nóng)作物新品種之一，同年獲得江蘇省利技進(jìn)步一等獎(jiǎng)，1997年獲國(guó)家科技成果轉(zhuǎn)化一等獎(jiǎng)。

泗棉3號(hào)植株高度中等，一般100厘米左右，株型疏朗呈塔形。葉片中等偏小，葉色偏淡，折褶明顯，向光性強(qiáng)。葉片空間排列合理，層次清晰，冠層結(jié)構(gòu)好，節(jié)間勻稱，消光系數(shù)小，中下部葉層受光條件好，花蕾外露，通透性好。莖桿茸毛較多。果樹上舉，彈性較好，有效受光面積大，群體光能利用率高。鈴型卵圓形，中等大小，鈴殼薄，吐絮暢。

泗棉3號(hào)出苗較好，棉苗長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，對(duì)肥水反應(yīng)彈性較大，生殖生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，現(xiàn)蕾開花早，第一果枝生節(jié)位較低，開花、成鈴、吐絮集中，結(jié)鈴性強(qiáng)，衣分高，成熟早，霜前花率高。

泗棉3號(hào)豐產(chǎn)性突出。自育成以來，在省內(nèi)外試驗(yàn)及大面積示范種植，均表現(xiàn)出良好的豐產(chǎn)性能，一般畝產(chǎn)80-100公斤，高產(chǎn)田塊達(dá)125公斤以上。大面積豐產(chǎn)方，皮棉單產(chǎn)達(dá)150公斤。1994年在江西省都昌縣萬戶鄉(xiāng)唐美村種植2.6畝泗棉3號(hào)高產(chǎn)田，單產(chǎn)皮棉達(dá)204公斤，創(chuàng)長(zhǎng)江流域皮棉單產(chǎn)量最高紀(jì)錄。

泗棉3號(hào)纖維品質(zhì)優(yōu)。江蘇省區(qū)試，纖維斷長(zhǎng)22.97千米，顯著優(yōu)于泗棉2號(hào)(21.09千米)，黃河流域區(qū)試鑒定：比強(qiáng)度20.9－麥克隆值4.6，達(dá)到國(guó)家“八五”攻關(guān)目標(biāo)。

泗棉3號(hào)抗病蟲性強(qiáng)。經(jīng)中國(guó)棉花所植保室、陜西省棉花所、河北省植保所兩年鑒定結(jié)果，平均枯萎病發(fā)病率為6.4％，病指為1.75，達(dá)高抗標(biāo)準(zhǔn)?？姑掴徬x性：經(jīng)中國(guó)農(nóng)科院植保所在地1993年抗性鑒定，泗棉3號(hào)蕾鈴受害率僅8.8％，比美國(guó)抗棉鈴蟲對(duì)照品種“HG-BR-8”(蕾鈴受害率15.32％)減退46.81％，抗性達(dá)I級(jí)高抗標(biāo)準(zhǔn)。抗蚜蟲性：1996年經(jīng)中國(guó)棉花所植保室鑒定，泗棉3號(hào)蚜害率對(duì)比照“非洲E40”(高抗)減退50.90％，達(dá)中抗標(biāo)準(zhǔn)。

泗棉3號(hào)適應(yīng)性廣。自育成以來，在省內(nèi)各地種植均表現(xiàn)出較大的增產(chǎn)幅度。在江蘇、安徽、江西、浙江、河南、湖南、湖北、山東、四川等省的不同棉區(qū)種植，均具有良好的適應(yīng)性，并得以大面積推廣應(yīng)用。曾年推廣面積連續(xù)兩年超過1000萬畝，是九十年代以來我國(guó)新育成的推廣面積最大的棉花品種。至2000年累計(jì)超過5000萬畝，新增社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益逾50億元。

泗棉3號(hào)是江蘇省1982年以來皮棉產(chǎn)量首次超過泗棉2號(hào)的棉花高產(chǎn)品種，打破了泗棉2號(hào)皮棉產(chǎn)量在江蘇省及長(zhǎng)江流域區(qū)試中連年獨(dú)占鰲頭的局面。同時(shí)還將江蘇省及長(zhǎng)江流域抗病棉的產(chǎn)量水平提高到一個(gè)新的高度，改變了長(zhǎng)期存在的高產(chǎn)品種不抗病或抗病品種不高產(chǎn)的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了棉花品種高產(chǎn)、抗病、抗蟲兼優(yōu)質(zhì)相統(tǒng)一的目標(biāo)，為我國(guó)棉花生產(chǎn)的發(fā)展作出了貢獻(xiàn)。

1.2方法

1.2.1種子處理

一般棉花種子處理有八種方法：

1.2.1.1曬種曬種可殺死病菌，增強(qiáng)抗病能力打破棉種休眠，提高發(fā)芽率，并可提早出苗1～2天。曬種一般多在播種前20天左右進(jìn)行。方法：選擇晴天將精選好的棉種攤到蘆席或土場(chǎng)上(攤放厚度3～5厘米)曝曬4～5天，每天翻動(dòng)3～5次，曬至用手搖響即可。

1.2.1.2溫湯浸種溫湯浸種可殺死附著在種子外和潛伏在種子內(nèi)部的病菌并起到催芽作用，同時(shí)兼有剔除未成熟種子和殺滅種子上害蟲(主要是棉紅鈴蟲)等作用。方法：將“三開一涼”60～65℃的溫開水倒入缸內(nèi)，放入曬選好的棉種(水和種子的比例是，攪拌均勻，浸悶30分鐘后撈出晾至種毛微白即可催芽或拌藥播種。為了保證缸內(nèi)棉種上下受溫一致，浸悶過程中隔1G鐘要上下攪拌一次。溫湯浸種催芽稍晾后，按浸種前3份干棉種加1份3％的呋喃丹微粒劑拌勻后再進(jìn)行播種，將有效地控制苗期蚜蟲危害。

1.2.1.3多菌靈膠懸劑浸種此法浸種對(duì)棉花炭疽病、立枯病防治效果好，對(duì)防治棉花枯、黃萎病也有一定作用。方法：40％多菌靈膠懸劑0～7公斤，兌水100公斤浸種50公斤，浸泡14小時(shí)后撈出播種。

1.2.1.4硫酸脫絨+“402”溫湯浸種此法可有效地防止枯、黃萎病發(fā)生和苗期病害，特別是外地引進(jìn)的種子經(jīng)此法處理后，其滅菌效果可達(dá)100％。

本實(shí)驗(yàn)采用硫酸脫絨法處理種子。選用硫酸脫絨后的種子，用75％的酒精洗1min，無菌水沖洗2～3次，再用20％的過氧化氫浸泡2h，然后無菌水沖洗3～4次，再放入充足的無菌水在28℃下泡24h，待露白后，換水在同樣條件下泡24h。除去種皮，將種仁接種到只含1／2MS無機(jī)鹽的固體培養(yǎng)基上，在黑暗、28℃條件下培養(yǎng)到子葉長(zhǎng)出，再見光培養(yǎng)1～2d。

1.2.2活性炭對(duì)莖尖的培養(yǎng)的影響將切好的莖尖轉(zhuǎn)到下面幾種濃度的活性炭(0.5g／L，10g／L，2.0g／L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在光照條件下培養(yǎng)，每天見光14h，光強(qiáng)均2000LX左右，培養(yǎng)溫度

25±2℃，大概20天左右，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況確定哪種活性炭濃度吸收次生代謝產(chǎn)物效果更好，更加有利于莖尖培養(yǎng)成再生植株。

1.2.3瓊脂和植物凝膠(Phytagel)對(duì)莖尖的培養(yǎng)的影響

傳統(tǒng)的凝固劑都是用瓊脂(8g／L)作為凝固劑，這里用sigma公司生產(chǎn)的植物凝膠(2.2g／L)做一個(gè)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)條件同1.2.2，大概20天左右，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)情況確定哪種作為凝固劑更加有利于莖尖培養(yǎng)成再生植株。

1.2.4嫁接對(duì)植株成活的影響

試管苗移植于室外，常常先使試管苗生根，然后移栽于花盆。但棉花的試管苗成活率低，而且此步驟共約2個(gè)月，耗時(shí)較長(zhǎng)。如果將試管苗嫁接于自然條件下的砧木上，不僅節(jié)省時(shí)間，而且避免與土壤(常常是蛭石)的直接接觸而減少污染，提高移植的成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度梯度的活性炭對(duì)莖尖再生的影響

活性炭能夠吸收外植體切口滲出的酚類物質(zhì)。三種濃度的活性炭中，濃度0.5g／L的活性炭處理下沒有明顯的促進(jìn)作用，苗發(fā)育狀態(tài)不好，與濃度1.0g／L處理下的苗存在一定的差異，濃度1.0g／L、2.0g／L處理下的莖尖發(fā)育的比較好，節(jié)間伸長(zhǎng)情況良好，葉片比較綠，基本無褐化現(xiàn)象，株型和正常苗相似?？梢娖湮沾紊x產(chǎn)物的效果最好。由于濃度2.0g／L的培養(yǎng)基比較影響對(duì)根的觀察，而且1.0g／L已經(jīng)達(dá)到了很好的效果，所以確定該組織培養(yǎng)中吸收次生代謝產(chǎn)物的最佳活性炭濃度是1.0g／L。

2.2不同凝固劑對(duì)莖尖再生的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以植物凝膠為凝固劑的培養(yǎng)基中植株再生情況良好，生長(zhǎng)速度明顯陜于瓊脂培養(yǎng)基上，基本只需要15天左右就能成苗，葉片長(zhǎng)勢(shì)很好，莖節(jié)發(fā)育良好，褐化現(xiàn)象不明顯，因此以后就以此為凝固劑，不僅縮短了實(shí)驗(yàn)周期而且提高了實(shí)驗(yàn)效果，同時(shí)我們可以看出在不加活性炭的條件下，用植物凝膠作為凝固劑，植株的褐化程度明顯降低。所以植物凝膠可以取代瓊脂作為該組織培養(yǎng)的凝固劑。

2.3嫁接對(duì)成苗的影響

嫁接對(duì)再生植株的根系沒有特殊要求，無根苗、褐根苗和一些畸形苗以及組織培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的變異苗等均可用于嫁接。實(shí)驗(yàn)中削去砧木頂端，將嫁接苗對(duì)接，用塑料袋或地膜罩蓋保濕。7d后解除石蠟?zāi)ず图?xì)繩，即可看到砧木和接穗已通過愈傷組織緊密地連結(jié)在一起，新的葉也已開始生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)嫁接成活率不是特別高，一般嫁接成活率可達(dá)到95％以上，嫁接時(shí)砧木與切口吻合不好，棉花苗齡過大，木質(zhì)化，一些操作不規(guī)范等都會(huì)影響嫁接的成活率。

3討論

泗棉3號(hào)，具有農(nóng)藝性狀優(yōu)良的特點(diǎn)，是長(zhǎng)江中下游的主要推廣品種，本實(shí)驗(yàn)以此為材料，研究了多種物質(zhì)對(duì)其莖尖培養(yǎng)的影響。由于其次生代謝產(chǎn)物對(duì)莖尖再生的抑制，為了去除這些次生代謝物選擇活性炭作為吸附劑，選擇幾個(gè)適宜的濃度，試驗(yàn)出最適合泗棉3號(hào)莖尖生長(zhǎng)的濃度為0.1g／L。加入活性炭以后生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的莖尖生長(zhǎng)很好，根部沒有發(fā)生褐化現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)采用了植株凝膠作為凝固劑，并且發(fā)現(xiàn)其處理下的莖尖不僅發(fā)育良好，而且周期很短，相比與瓊脂作為凝固劑培養(yǎng)的周期大大縮短了，這樣可以縮短組織培養(yǎng)的進(jìn)程，同而且植物凝膠在實(shí)驗(yàn)的操作中還有更多的便利：瓊脂里雜質(zhì)較多，滅菌后可能會(huì)出現(xiàn)抑制物質(zhì)。

由于直接煉苗移栽等定植方法成活率較低，緩苗時(shí)間較長(zhǎng)，棉花屬于木本植物，用此方法更困難。而嫁接能夠極大地提高再生植株的定植成活率，更能縮短緩苗時(shí)間，為基因工程乃至其他生物技術(shù)能夠順利地應(yīng)用于棉花遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。