不同方法檢測食品中單核細胞增生李斯特菌比較

蘇靖華

單核細胞增生李斯特菌廣泛分布于自然界，污染肉禽類、乳類、魚貝類及蔬菜等食品引發(fā)食物中毒。新生兒、高齡孕婦和免疫力低下者易感染，主要引起腦膜炎和敗血癥，死亡率較高。美國、英國、加拿大等國多次爆發(fā)由該菌污染空心菜、奶酪等引起食物中毒，病死率達30％以上。

一般基層單位主要采用國家標準檢測食品中單核細胞增生李斯特菌，常規(guī)檢測流程從分離、培養(yǎng)、鑒定都沿用傳統(tǒng)方法，需要6～7 d甚至更長，菌落形態(tài)識別難，受主觀人為因素影響大，陽性率低。近年來發(fā)展出新型顯色平板、API生化鑒定試劑及PCR技術(shù)等快速檢測方法，提供了更快捷高效的檢測手段。為探索更優(yōu)化的單核細胞增生李斯特菌檢測方法，我們對從區(qū)內(nèi)食品污染物監(jiān)測點采集6類361件食品樣品，選用3種方法檢測單核細胞增生李斯特菌，并對這幾種方法進行比較。お

1 材料與方法

1.1 標本來源

從區(qū)內(nèi)集貿(mào)菜場、大中型超市采集各類食品，包括生畜禽肉、熟肉制品、豆制品、水產(chǎn)品、速凍米面制品、生食蔬菜共6大類361件樣品。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

李氏增菌肉湯、TSA-YE瓊脂、EB增菌液，MMA瓊脂、SIM動力培養(yǎng)基、血瓊脂、各種糖發(fā)酵培養(yǎng)基等均為上海市疾病預(yù)防控制中心提供的干粉制品，使用時按說明書配制而成。李斯特菌顯色平板為科瑪嘉公司生產(chǎn)的成品。API Listeria 10300生化鑒定試劑盒由法國梅里埃公司生產(chǎn)。PCR試劑盒由佳寧科技公司生產(chǎn)。以上培養(yǎng)基和試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 檢驗方法

1.3.1 食品微生物檢驗（方法1） 按照食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗GB/T4789.31—2003的方法，取檢樣25 g打碎，加入225 mL LB₁增菌液混勻，于30℃環(huán)境培養(yǎng)24 h，吸出0.1 mL加入10 mL LB₂增菌液中，再于30℃環(huán)境培養(yǎng)24 h。分離MMA平板,于30℃環(huán)境培養(yǎng)48 h,挑5～6個可疑菌落接種三糖鐵瓊脂和SIM動力培養(yǎng)基。選擇三糖鐵瓊脂上、下層產(chǎn)酸、動力呈傘狀者在TSA-YE平板上純培養(yǎng)，進一步作染色鏡檢、溶血試驗和各種傳統(tǒng)生化試驗。

1.3.2 食品污染監(jiān)測（方法2） 按照上海市食品污染物監(jiān)測方案的方法，2次增菌后，分離科瑪嘉李斯特菌顯色平板，于36℃環(huán)境培養(yǎng)24 h，挑5～6個可疑菌落接種木糖、鼠李糖，同時在TSA-YE平板上純培養(yǎng)。選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物進一步作染色鏡檢、生化試驗等，生化試驗用API Listeria 10300生化鑒定試劑盒。

1.3.3 PCR篩選法（方法3） 對LB₂增菌液用美國Opticon2熒光定量PCR系統(tǒng)進行單核細胞增生李斯特菌篩選，陽性者按1.3.2方法分離科瑪嘉李斯特菌顯色平板后培養(yǎng)驗證。お

2 結(jié)果

2.1 不同方法檢測結(jié)果

方法1檢測361件樣品，其中2件檢出單核細胞增生李斯特菌（生畜禽肉1件，速凍米面制品1件），陽性率為0.55％。方法2檢測361件樣品，其中9件檢出單核細胞增生李斯特菌（生畜禽肉7件，速凍米面制品2件），陽性率為2.49％。方法3檢測經(jīng)Opticon 2熒光定量PCR系統(tǒng)從LB₂增菌液篩選出11件陽性樣品，將其分離科瑪嘉李斯特菌顯色平板，挑可疑菌落經(jīng)染色鏡檢、生化試驗等證實為單核細胞增生李斯特菌陽性的有10件（生畜禽肉8件，速凍米面制品2件），陽性率為2.77％。

2.2 方法2與方法1比較

方法1檢測單核細胞增生李斯特菌陽性率為0.55%；方法2檢測單核細胞增生李斯特菌陽性率為2.49%。兩種方法均檢出陽性樣品2件，兩種方法均為陰性的352件，方法2陽性而方法1陰性的有7件，見表1。經(jīng)統(tǒng)計分析，兩者陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ²=5.14，P<0.05)。以方法1為標準，方法2敏感度為100.00％（2/2），特異度為98.05％，假陰性率為0.00％，假陽性率為1.95％。お

2.3 方法3與方法1比較

方法1檢測單核細胞增生李斯特菌陽性率為0.55%，方法3檢測單核細胞增生李斯特菌陽性率為2.77%。兩種方法均檢出陽性的樣品有2件，兩種方法均為陰性的351件，方法3陽性而方法1陰性的有8件，見表2。經(jīng)統(tǒng)計分析，兩者陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ²=6.13，P<0.05)。以方法1為標準，方法3敏感度為100.00％(2/2)，特異度為97.77％，假陰性率為0.00％，假陽性率為2.23％。お

2.4 方法3與方法2比較

方法2檢測單核細胞增生李斯特菌陽性率為2.49%，方法3檢測單核細胞增生李斯特菌陽性率為2.77%。兩種方法均檢出陽性樣品有9件，兩種方法均檢出陰性樣品有351件，方法3陽性而方法2陰性的有1件，見表3。兩者陽性率無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.5)。 お

3 討論

單核細胞增生李斯特菌是一種重要的食源性致病菌，在國外食品中的污染率達5％～30％，感染后病死率高達30％～70%。在世界范圍內(nèi)確認的爆發(fā)事件近20起，引起爆發(fā)的食物有蔬菜、奶酪、肉制品和熏制的海產(chǎn)品等。2008年8月加拿大發(fā)生李斯特菌食物中毒事件，污染源為楓葉公司生產(chǎn)的熟肉食品，造成10多人死亡。我國雖未有爆發(fā)性流行，但也加強了食品中單核細胞增生李斯特菌的污染調(diào)查，可是往往傳統(tǒng)的檢測手段耗時耗力、漏檢誤檢，造成陽性率偏低。

本組資料中361件樣品選用3種檢驗方法進行平行檢測，相比之下國標法（GB/T4789.31-2003）檢測單核細胞增生李斯特菌的陽性率較低，其它2種方法有助于提高陽性率。國標法中MMA平板菌落形態(tài)視覺上很難辨別，且只能確定可疑菌落為李斯特菌屬,然后再通過一定的生化試驗檢出單核細胞增生李斯特菌，而溶血試驗的結(jié)果判讀受主觀因素影響較大?？片敿卫钏固鼐@色平板上雜菌少，單核細胞增生李斯特菌菌落為藍色帶白色暈圈，特征明顯，容易識別，很大程度上減少了人為影響。居建華等統(tǒng)計顯示，可疑菌落的確定概率>95%，是MMA平板的3倍多。生化鑒定時用APL listeria 10300生化鑒定試劑盒與傳統(tǒng)生化管相比，時間僅需1 d，也很容易掌握。PCR技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)相當成熟，并且已應(yīng)用于單核細胞增生李斯特菌的檢測。方法1中的2件陽性樣品和方法2中的9件陽性樣品經(jīng)pticon 2熒光定量PCR系統(tǒng)篩選均為陽性，用常規(guī)培養(yǎng)法驗證，結(jié)果全都分離到單核細胞增生李斯特菌，方法3與方法2雖然在陽性率上無差異，但提高了工作效率，表明PCR檢測方法快捷可靠。常規(guī)法檢測至少需要7 d，PCR法可在幾個小時內(nèi)得出初篩結(jié)果，有利于食品污染的監(jiān)測和食物中毒事件的快速反應(yīng)。

方法3中經(jīng)PCR系統(tǒng)篩選陽性的11件樣品，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)鑒定有1件未檢出，分析原因有2種可能：①菌已死亡，因為PCR檢測的是核酸而非活菌。②樣品中單核細胞增生李斯特菌含量很低，PCR方法靈敏度高能檢測到，而在平板上未能分離到。

實驗證明，科瑪嘉李斯特菌顯色平板及PCR技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，較低的假陽性率和假陰性率，無疑為準確、快速檢測提供了新的選擇，特別是樣品量較大時，更加顯示其優(yōu)勢。對大量樣品進行篩檢時，建議可以先多個樣品合并一組用PCR技術(shù)進行初篩，結(jié)果陽性者再對該組逐個作科瑪嘉李斯特菌顯色平板分離培養(yǎng)，挑可疑菌落接種純分離TSA-YE平板，再轉(zhuǎn)種SIM動力管、點種血瓊脂平板，凡符合25℃時呈傘狀動力、血平板上菌落有狹小透明溶血環(huán)者，用APL listeria 10300生化鑒定試劑盒作生化鑒定。這樣就縮短了檢驗周期，提高了工作效率（減少了許多平板分離、形態(tài)識別及生化試驗工作量），同時多種手段相結(jié)合，避免了漏檢、誤檢，提高了陽性檢出率，能較快得出正確結(jié)果。

由于方法2與方法3中單核細胞增生李斯特菌陽性檢出率比較接近，樣本量（361件樣品）又較小，難于對其檢測效果進行評價，有待以后擴大樣本含量作進一步探討。お

4 參考文獻

［1］王捷.李斯特菌食物中毒.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，1999，26：550-552.

［2］吳蜀豫，李迎惠，冉陸，等.中國2001年11省（市）食品中李斯特菌污染狀況的主動監(jiān)測.中華流行病學(xué)雜志,2003,24(8):657-659.

［3］居建華，葉虹，顧偉忠，等.應(yīng)用不同培養(yǎng)基檢測單增李斯特菌結(jié)果比較.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，20（1）：32-33.

［4］何浩，吳永生，于霞.產(chǎn)單核細胞增生性李斯特菌研究現(xiàn)狀.肉品衛(wèi)生，2003，7:9-16.

(收稿日期：2009-02-09)