大孔樹脂吸附法提取丹參中丹酚酸Ｂ的實驗研究

王建佳　王永江　胡廣利

摘要:目的:改進(jìn)丹酚酸B的提取工藝,促進(jìn)丹參制劑的發(fā)展。方法:采用SIPI905型大孔樹脂用于丹酚酸B的提取分離,用HPLC法測定含量,考察大孔樹脂的最佳工藝條件。結(jié)果:采用SIPI905型大孔樹脂在4倍量的15%的乙醇洗脫條件下進(jìn)行洗脫,得到的丹酚酸B的純度為86.20%,精制度為252.62%。結(jié)論:SIPI905型大孔樹脂能明顯提高丹酚酸的收率和純度?？蛇m用于工業(yè)生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞 丹酚酸B;大孔樹脂;提取;丹參

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為上品,歷代本草均有收載。丹參歸心、肝經(jīng),藥性微寒,味苦、無毒,具有祛瘀止痛、活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效[1]。其主要的藥理作用部位分為水溶性和脂溶性兩部分?？偟し铀崾堑⒌乃苄杂行С煞种? 在抗肝纖維化、抗動脈粥樣硬化及細(xì)胞凋亡方面具有顯著的活性[2],是目前臨床上治療冠心病、慢性肝炎等疾病的常用藥物之一,其中丹酚酸B的含量最高,且活性最強(qiáng),實驗表明丹酚酸對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[3],對心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞也有延遲保護(hù)作用[4],同時能抗血栓[5]、改善β-淀粉樣蛋白對神經(jīng)元的毒性作用[6],增強(qiáng)老化紅細(xì)胞提高T淋巴細(xì)胞分泌[7],具有抗衰老,抗腫瘤作用。

目前醇沉是被廣泛應(yīng)用的提取純化工藝,70%醇沉法在沉去大量雜質(zhì)同時,水溶性酚酸損失50%以上,丹參酮ⅡA則損失2/3以上,原兒茶醛亦有損失;60%醇沉法丹參酮ⅡA稍有損失[8]。由于丹酚酸在水溶液中不穩(wěn)定,提取時受熱易破壞,損失可達(dá)30%,如何尋找一種高效、實用的提取純化工藝是丹酚酸B進(jìn)一步開發(fā)研究的重要環(huán)節(jié)。本實驗通過考察SIPI905型大孔吸附樹脂對丹酚酸B的吸附能力,證明在丹酚酸的提取分離過程中,大孔樹脂能明顯提高丹酚酸B的純度和收率。

1 藥材與對照品

丹參藥材由哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠提供, 經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)都曉偉教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根。

丹酚酸B(中國藥品生物制品檢定所)批號為111562-200706。

2 儀器與試劑

Waters515高效液相色譜儀;ORION MODEL 828型pH計;BP210S電子天平(德國Sartorius);KDM 型控溫電熱套(山東鄄城華魯儀器公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52 (上海亞榮生化儀器廠) ;BRANSON SB3200-T型超聲儀。SIPI905型大孔吸附樹脂(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院)。

甲醇為色譜純。

乙醇、冰醋酸均為分析純;水為超純水(過0.145μm 濾膜)。

3 方法與結(jié)果

3.1 丹酚酸B的含量測定

3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品12.01mg,用H2O溶解并定容于10ml容量瓶中作為對照品溶液,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.1.2 樣品溶液的制備 藥材粉碎過20目篩,混勻后用8倍量水浸泡1.5h,煎煮1.5h,第2次加6倍量水,煎煮1.0h,采用50%乙醇醇沉。制成比重為1.08的浸膏[9]。

取上述浸膏0.5g,置100mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液,于4℃保存?zhèn)溆?臨用前,以0.45μm微孔濾膜過濾)。

3.1.3 色譜條件色譜柱Diamonsil ODS Cl8(200mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇:0.5%冰醋酸(1:7);流速:1.0ml/min;柱溫:35℃;檢測波長:281nm;進(jìn)樣量:20μl。

3.1.4 線性關(guān)系考察 分別取“3.1.1項” 對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6ml,加水定容至10ml, 得濃度為12.01、24.02、48.04、96.08、144.12、192.16μg/ml的對照品溶液,搖勻。按“3.1.5項”色譜條件分別進(jìn)樣,以對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以丹酚酸B溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X),得回歸方程:Y=0.0233X+0.0481,r=0.9999,在12.01～192.16mg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.1.5 精密度考察 分別取對照品溶液低、中、高種濃度按“3.1.5項”色譜條件做精密度實驗,結(jié)果表明日內(nèi)精密度為1.08%,日間精密度RSD為1.84%。

3.1.6 穩(wěn)定性考察 供試品溶液配制好后,每隔1h測定一次,結(jié)果顯示5h內(nèi)丹酚酸B的峰面積穩(wěn)定,RSD為1.02%(n=5)。

3.1.7 回收率試驗 取5份已知濃度為30.42mg/ml的樣品5ml,分別加入對照品7.34、7.53、7.28、7.45、7.50mg適量,按“3.1.5項”色譜條件分別進(jìn)樣測定,結(jié)果顯示平均加樣回收率為99.78%,RSD為1.05%(n=5)。

3.2 SIPI905型大孔樹脂提取丹酚酸B的工藝考察

3.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理及裝柱 取SIPI905型大孔樹脂用10倍量95%乙醇浸泡24h,濕法裝柱,用95%乙醇沖洗,至洗出液加適量水混合無白色渾濁現(xiàn)象,最后用蒸餾水洗至無醇味,備用。

3.2.2 吸附容量的測定 精密量取樣品溶液10ml上SIPI905型大孔樹脂柱(1.5cm×25cm,濕樹脂25g),控制流速1ml/min,過柱液流出后重吸附1次,靜置30min,以蒸餾水沖洗,收集過柱液至10ml,平行操作3次,按“3.1.5項”色譜條件測定丹酚酸B含量,計算吸附容量(吸附容量為單位質(zhì)量濕樹脂吸附丹酚酸B的質(zhì)量),結(jié)果表明其吸附容量為8.85mg/g(n=3)。

3.2.3 洗脫液的選擇 精密量取樣品溶液10ml,上SIPI905型大孔樹脂柱(濕樹脂100g),控制流速1ml/min,過柱液流出后重吸附1次,靜置30min,依次用蒸餾水、10%乙醇、15%乙醇、20%乙醇、25%乙醇、30%乙醇各100ml洗脫,按“3.1.5項”色譜條件檢測丹酚酸B。結(jié)果表明,丹酚酸B集中在15%乙醇洗脫液中,10%與20%乙醇雖能洗出丹酚酸B,但洗脫能力弱,其余洗脫液則均不含丹酚酸B,故確定15%乙醇為洗脫液。

3.2.4 精制程度考察 精密量取樣品溶液10ml,上SIPI905型大孔樹脂柱(濕樹脂100g),控制流速1ml/min,過柱液流出后重吸附1次,靜置30min,依次用蒸餾水、15%乙醇進(jìn)行洗脫。洗脫體積分別為2、3、4、5倍量。另精密量取樣品溶液10ml和醇洗脫液分別濃縮,干燥,稱重,按“3.1.5項”色譜條件測定丹酚酸B含量。結(jié)果顯示,在4倍量洗脫液體積的洗脫下,結(jié)果最理想,樣品溶液固形物為1.47g,丹酚酸B含量為35.43%,醇洗脫液固形物為0.65g,丹酚酸B含量為86.20%, 丹酚酸B洗脫率為96.98%,精制程度為252.62%。

4 討論

丹參的藥用價值已經(jīng)開始被臨床廣泛關(guān)注。丹參中水溶性成分以丹酚酸B的含量最高,有很好的開發(fā)前景。本文采用SIPI905型大孔樹脂改進(jìn)了丹酚酸B的提取工藝,具有吸附快,吸附容量大,洗脫率高等優(yōu)點,比傳統(tǒng)工藝[10]具有非常明顯的優(yōu)勢,可以顯著的提高丹酚酸的收率和純度,而且方法操作簡單,樹脂再生簡便,適合工業(yè)化生產(chǎn),可有利促進(jìn)丹參制劑的發(fā)展,具有較高的實用價值。

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