耐鹽基因Ｈａｌ１的克隆及表達載體的構(gòu)建

沈　雁　陳　霞　陳　燕　龔　毅　陳宇光

摘要 以酵母菌株BWG1-7A基因組DNA為模板，利用PCR方法，擴增出耐鹽基因Hal1，測序表明該基因全長為885個核苷酸，與已發(fā)表的序列NC_001148比較，同源性99.3%。將該基因插入表達載體pYES2的BamHI和EcoRI酶切位點之間，構(gòu)建表達載體pYES2-Hal1，序列測定完全正確，為植物表達載體的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 耐鹽性；Hal1基因；克隆

中圖分類號 Q785 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2009）07-0243-02

Cloning of Hal1 gene and construction of its expression plasmid

SHEN Yan1，2 CHEN Xia1 CHEN Yan GONG Yi 1 * CHEN Yu-guang 2

（1 Research Center of Biotechnology Shanghai Institutes for Biological Sciences the chinese Academy of Sciences，Shanghai 200233；

2 School of life Sciences，Shanghai University）

Abstract Taking Saccharomyces cerevisiae BWG1-7A genomic DNA as template，Hal1 gene is amplified by PCR. The amplified product was digested with BamHI and EcoRI enzymes，then ligated into pYES2 vector. The recombinant pYES-Hal1 was successfully constructed and verified by DNA sequence，which provided a foundation of the construction of plant expression vector.

Key words Salt tolerance；Hal1 gene；Cloning

隨著全球水資源危機以及土壤鹽化問題的加劇，鹽脅迫已經(jīng)成為影響植物生長、導(dǎo)致糧食和經(jīng)濟作物減產(chǎn)的主要限制因素[1]。目前，全世界大約有20%的農(nóng)業(yè)用地的鹽堿化程度在不斷加重，預(yù)計到2050年，將會有超過50%的耕地會變得鹽堿化[2]。在當前世界人口急劇增長、食品供給增長相對緩慢的情形下，只有采取一定的措施應(yīng)對日趨嚴重的環(huán)境壓力，才能確保人類的食品安全，維持農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。為了達到這一目標，就必須了解鹽脅迫對植物生長發(fā)育的影響，弄清植物耐鹽的機制，并通過農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)手段改良農(nóng)作物，以增強它們的耐鹽性，使其最終為人類的生產(chǎn)和生活服務(wù)。耐鹽基因Hal1最初來源于啤酒酵母的第16號染色體，具有提高細胞中K+含量，降低Na+含量，也就是提高K+/Na+的比率[3，4]，從而可以提高細胞耐鹽性的作用。本研究成功克隆了耐鹽基因Hal1，并將它連接到pYES2表達載體上，測序表明其與已發(fā)表的序列比較，同源性99.3%，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-Hal1，序列測定完全正確，為下一步利用該基因提高生物的耐鹽水平提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

釀酒酵母BWG1-7A，大腸桿菌菌株DH5α，JM109，質(zhì)粒pYES2均為中科院上海生命科學(xué)研究院實驗室保存；KOD酶購自TOYOBO公司，T4連接酶、BamHI和EcoRI酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司；引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成；其他化學(xué)試劑購自上海生工公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母基因組ＤＮＡ的提取。將活化的菌種接種于YPD培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，收集菌體后用Lyticase 酶解酵母細胞壁獲得原生質(zhì)體，參照亞當斯A等[5]采用SDS裂解酵母細胞，提取酵母基因組總DNA。

1.2.2 Hal1基因的擴增。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中Hal1基因序列信息（序列登記號：NC_001148），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，上游引物（P1）為5′－CGCGGATCCAT GCATTTCAAAGATTTAGGATTGCATACTACACTC－3′， 下游引物（P2）為5′-CCGGGAATTCTCAACTATTCTGT GTTG－3′，下劃線分別代表BamHI和EcoRI酶切位點。在20μL PCR反應(yīng)體系中加入模板DNA 1μL，10×反應(yīng)緩沖液2μL，2.5 mmoL/L dNTP 1μL，P1和P2引物均為5μmoL/L，KOD酶0.5IU，94℃預(yù)變性5min后，進行PCR循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為：94℃變性50s，53℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后72℃延伸10min。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定。將Hal1基因的PCR產(chǎn)物和pYES2載體經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切，酶切產(chǎn)物分別回收，以1∶3比例連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐平板上。隨機挑取3個菌落（1，2，3），擴大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，酶切鑒定后測序鑒定，重組質(zhì)粒命名為pYES2-Hal1。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hal1基因的PCR擴增

利用引物（P1，P2），以釀酒酵母基因組總DNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到了1條900bp左右的單一條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。

2.2 Hal1基因的克隆

將上述PCR產(chǎn)物酶切回收與pYES2連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將隨機挑取的菌落擴增后提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI進行酶切鑒定，第3號克隆酶切后電泳得到約900bp大小的片斷（見圖2）。

2.3 重組質(zhì)粒pYES2-Hal1序列測定

進而將3號克隆測序，結(jié)果顯示，該核苷酸序列與Genbank數(shù)據(jù)庫已報道的序列相比，同源性為99.3%（見圖3）。

3 結(jié)論與討論

釀酒酵母BWG1-7A具有較強的耐鹽能力，可在含有7%NaCl的YPD培養(yǎng)基中生長。本試驗通過PCR技術(shù)，成功地從其DNA中克隆到耐鹽基因Hal1。測定的陽性克隆序列，與GenBank上公布的Hal1基因相比較，其核苷酸同源性為99.3%。與已發(fā)表的序列同源，將為Hal1基因植物表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化提供有力保障。

酵母菌的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達和調(diào)控過程等都與高等生物具有一致性，因此已將其作為一種研究農(nóng)作物耐鹽機制的模式生物得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究采用的釀酒酵母，是分離耐鹽基因的有效模型，有助于高等植物耐鹽分子機理的研究，推動抗?jié)B透脅迫工程的發(fā)展。

鹽堿地是巨大的潛在資源，綠化鹽堿地是擴大耕地面積，進一步發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、改善生態(tài)環(huán)境的重要措施。利用基因工程手段培育能在鹽堿地上種植的林木，是利用鹽堿地的一條經(jīng)濟而有效的途徑。釀酒酵母Hal1基因在鹽脅迫下能與促進Na+外排的ENA1基因及其他轉(zhuǎn)運系統(tǒng)協(xié)同作用保持細胞內(nèi)低的Na+/K+比，以減輕Na+毒害，因而在植物耐鹽基因工程上具有很大的潛力[3]。

4 參考文獻

[1] 周和平，張立新，禹鋒，等.我國鹽堿地改良技術(shù)綜述及展望[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（11）：159-164.

[2]V INOCUR B，ALTMAN A. Recent advances in engineering p lant tolerance to a biotic stress： achievements and lim-itations[J].Current Opinion in Biotech-nology，2005（16）：123-132.

[3] R GAXIOLA，IF DE LARRINOA，JM Villalba，et al.A novel and conserved salt-induced protein is an important determinant of salt tolerance in yeast[J].EMBO，1992，11（9）：3157-3164.

[4] MARQUEZ JA，SERRANO R.Multiple transduction pathways regulate the sodium-extrusion gene PMR2/ENA1 during salt stress in yeast[J]. FEBS letters，1996（382）：89-92.

[5] 亞當斯A，戈特施林D E，凱澤C A. 酵母遺傳學(xué)方法實驗指南[M].劉子鐸，譯.北京：科學(xué)出版社，1998.

[6] BORDAS M，MONTESINOS C，DABAUZA M，et al. T ransfer of the yeast salt to lerance gene HAL 1 to cucum isme cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance[J].Transgenic Res，1997，6（1）：41-50.