制備腎臟掃描電鏡樣品的技術(shù)方法改良

崔 芳，喬 君，王 一，王 麗*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神科，河北石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院超聲科，河北石家莊 050000）

·技術(shù)方法·

制備腎臟掃描電鏡樣品的技術(shù)方法改良

崔 芳1，喬 君2，王 一3，王 麗1*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神科，河北石家莊 050031；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院超聲科，河北石家莊 050000）

腎小球；顯微鏡檢查，電子，掃描；研究技術(shù)

腎臟組織的超微結(jié)構(gòu)研究主要集中在腎小球，通常使用透射電鏡經(jīng)過(guò)超薄切片觀察細(xì)胞器的二維平面變化［1-3］。隨著研究的深入，愈發(fā)需要滿足不同的科研目的及特殊的臨床要求。冷凍割斷技術(shù)是一種可以觀察組織細(xì)胞內(nèi)部的掃描電鏡（scanning electronmicroscope，SEM）制樣技術(shù)，它充分顯示了內(nèi)部結(jié)構(gòu)的三維立體形象，具有不可替代的地位，但因有取材要求高、操作流程長(zhǎng)、設(shè)備裝置多、成本價(jià)格高、傷害污染重等不足［4］，限制了廣泛應(yīng)用。而常規(guī)樣品表面制備方法無(wú)法準(zhǔn)確找到腎小球，即使從切割的部位找到腎小球，往往由于取材切割的擠壓而使結(jié)構(gòu)雜亂無(wú)章。為再現(xiàn)腎小球的三維形態(tài)，我們將常規(guī)制備SEM樣品的技術(shù)方法進(jìn)行改良，既能如冷凍割斷一般，顯示組織細(xì)胞內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)，又具有取材方便易行、操作簡(jiǎn)單輕松、樣品易于保存、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高等特點(diǎn)，從而為腎臟及與之類似組織的超微結(jié)構(gòu)研究提供新思路?，F(xiàn)將此方法具體介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料：動(dòng)物，雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠3只（河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），2只成年大鼠體質(zhì)量在300g左右，1只老年大鼠體質(zhì)量500g。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)SEM樣品制備：10%水合氯醛（0.5mL/100g）腹腔注射麻醉成年大鼠，取右側(cè)臥位，腹膜后暴露分離出腎臟組織，預(yù)冷的雙面刀片從腎臟皮質(zhì)部位切取5mm×5mm×5mm的組織塊，放于2.5%戊二醛固定液中固定4h。施以常規(guī)表面掃描樣品制備法，乙醇梯度脫水；叔丁醇干燥；IB-3離子噴鍍儀鍍膜；日立S-3500N SEM觀察。

1.2.2 改良SEM樣品制備：動(dòng)物麻醉成功后快速開(kāi)胸暴露心臟，將輸液針刺入左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，經(jīng)心-升主動(dòng)脈先灌注37℃生理鹽水200mL沖凈血液，再灌注4℃含有2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的磷酸緩沖液（pH 7.4）400mL/只，最初10min快速灌注，后維持1h。后取材固定等操作同常規(guī)制樣。

2 結(jié) 果

2.1 常規(guī)制樣的觀察：低倍鏡下腎小球較清楚，能與周圍的腎小囊及泌尿小管區(qū)別出來(lái)，但周圍組織結(jié)構(gòu)混亂，大量組織擠壓、移位并覆蓋在表面（圖1）。高倍鏡下可見(jiàn)足細(xì)胞胞體和胞體上依次伸出初、次級(jí)突起，偶見(jiàn)三級(jí)突起（圖2），次級(jí)和三級(jí)突起朝向血管球基膜（glomrular basement membrane，GBM）的一側(cè)呈膨大狀，緊貼在GBM上，而胞體和初級(jí)突起則突向腎小囊腔，不直接貼附于GBM上，之間形成的間隙由鄰近的突起伸入，但各級(jí)突起間相互連接交叉的關(guān)系不清楚（圖3）；相鄰次級(jí)突起或細(xì)胞自身的次級(jí)突起相互穿插鑲嵌形成的柵欄狀結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，表現(xiàn)為突起的粗細(xì)不均，長(zhǎng)短不諧，排列紊亂，突起間隙（即濾過(guò)裂隙）也模糊不清；其余結(jié)構(gòu)無(wú)法辨認(rèn)（圖4）。

2.2 改良制樣的觀察：成年大鼠，低倍鏡下腎小球與腎小囊分界清晰，周邊是近端小管等泌尿小管的管腔斷端（圖5）。高倍鏡下可清楚地看到飽滿的足細(xì)胞，外形如蜘蛛樣，攀附于毛細(xì)血管外周，胞體較大，表面清晰可辨散在的微絨毛（圖6），其伸出的初級(jí)突起，進(jìn)一步發(fā)出大量指狀的次級(jí)突起，有的次級(jí)突起再分出少量三級(jí)突起（圖7）；由初級(jí)突起垂直伸出系列平行的次級(jí)突起，后者又規(guī)律性的彼此鑲嵌穿插，呈柵欄樣排列整齊，走形分明，朝向GBM膨大的次級(jí)和三級(jí)突起，緊貼在GSM上，胞體、初級(jí)突起與GBM之間的間隙，由鄰近的突起伸入填充，濾過(guò)裂隙也清晰可見(jiàn)（圖8）；在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的腔面，可見(jiàn)典型的有孔型內(nèi)皮（圖9）；在腎小囊壁層為扁平多邊形細(xì)胞，細(xì)胞核突向腎小囊腔，細(xì)胞表面有稀疏散在的微絨毛，各別有單根中央纖毛（圖10）。

老年大鼠，低倍鏡成像能清楚辨認(rèn)出腎小球及周圍小管的結(jié)構(gòu)。高倍鏡下可見(jiàn)腎小球足細(xì)胞胞體及初級(jí)突起皺縮、塌陷，有的足突上還有不明贅生物（圖11）；有的次級(jí)突起及以下分支腫脹、融合，柵欄狀結(jié)構(gòu)排列紊亂，缺少突起貼附，暴露出GBM，濾過(guò)裂隙變窄（圖12）。

圖1 常規(guī)制樣的低倍鏡觀察，示腎小球、腎小囊和泌尿小管，但周圍組織結(jié)構(gòu)混亂，大量組織殘?jiān)采w在表面（×1 500）圖2 常規(guī)制樣的高倍鏡觀察，示足細(xì)胞胞體，表面覆有組織殘?jiān)?，影響觀察（×6 000）圖3 常規(guī)制樣的高倍鏡觀察，足細(xì)胞胞體及其伸出的各級(jí)突起，但各級(jí)突起間相互連接交叉的關(guān)系不很清楚圖4 常規(guī)制樣的高倍鏡觀察，各級(jí)突起都粗細(xì)不均，長(zhǎng)短不諧，排列紊亂（×18 000）圖5 改良的成年大鼠低倍鏡觀察，腎小球與腎小囊分界清晰，周邊是近端小管等泌尿小管的管腔斷端（×1 000）圖6 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，示飽滿的蜘蛛樣足細(xì)胞，攀附于毛細(xì)血管外周，胞體表面有散在的微絨毛（↑示）（×5 000）圖7 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，足細(xì)胞胞體伸出初級(jí)、次級(jí)和三級(jí)突起（×10 000）圖8 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，柵欄狀結(jié)構(gòu)排列整齊，走形分明，濾過(guò)裂隙清晰（×20 000）圖9 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，示典型的有孔型毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腔面（×20 000）圖10 改良的成年大鼠高倍鏡觀察，扁平多邊形的腎小囊壁層細(xì)胞，細(xì)胞核突向腎小囊腔，細(xì)胞表面有稀疏散在的微絨毛，各別有單根中央纖毛（↑示）（×3 000）圖11 改良的老年大鼠高倍鏡觀察，足細(xì)胞胞體及初級(jí)突起皺縮、塌陷，各級(jí)突起上有不明贅生物（↑示）（×10 000）圖12 改良的老年大鼠高倍鏡觀察，次級(jí)突起及以下分支腫脹、融合，柵欄狀結(jié)構(gòu)排列紊亂，缺少突起貼附，暴露出GBM（×10 000）

3 討 論

通過(guò)上述對(duì)比觀察可以看出常規(guī)SEM樣品制備的腎臟組織，雖然能看到腎小球大體結(jié)構(gòu)，但具體形態(tài)及與周圍組織間的相互關(guān)系并不十分清晰，造成這一現(xiàn)象的主要原因在于樣品切割取材后放入固定液，必然導(dǎo)致結(jié)構(gòu)受擠及生活狀態(tài)超微結(jié)構(gòu)的改變。而經(jīng)過(guò)技術(shù)改良的腎臟組織，先經(jīng)心臟進(jìn)行全身灌流固定，使其保持了良好的生活狀態(tài)超微結(jié)構(gòu)，所以在觀察時(shí)可以非常清楚全面地辨別出腎小球、腎小管的形態(tài)及足突走向，甚至還可以觀察到腎小球的有孔型毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)，而這些結(jié)構(gòu)在常規(guī)制樣的腎臟中均未見(jiàn)到；在一些生理或病理情況下，如肥胖老年大鼠，腎小球足突發(fā)生的結(jié)構(gòu)改變，也很清晰直觀地表現(xiàn)出來(lái)，改變了以往只能用冷凍割斷技術(shù)觀察腎臟組織內(nèi)部立體結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)［5］，為之提供新的思路；而且對(duì)于異地取材，技術(shù)改良使樣品易于保存，不再受時(shí)間限制，加之制樣時(shí)間縮短，操作簡(jiǎn)便，使SEM能以三維立體直觀形象的成像視角更好地表現(xiàn)了不同于透射電鏡的圖像，為廣大腎病研究者提供更有效的技術(shù)方法。擴(kuò)展開(kāi)來(lái)也可進(jìn)一步廣泛應(yīng)用于其他與之類似的組織觀察。

［1］ GARROSA M，LLANES F，GAYOSO MJ.Histopathological changes in gerbil liver and kidney after aluminum subchronic intoxication［J］.Histol Histopathol，2011，26（7）：883-892.

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［4］ 應(yīng)國(guó)華.電鏡技術(shù)與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)［M］.香港：現(xiàn)代出版社，1993：59-79.

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（本文編輯：劉斯靜）

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B

1007-3205（2012）03-0357-03

2011-10-13；

2011-11-01

崔芳（1980-），女，河北正定人，河北醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心助理實(shí)驗(yàn)師，從事電子顯微學(xué)研究。

*通訊作者。E-mail：wl601021@yahoo.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.047