肝移植相關(guān)的缺血再灌注損傷

關(guān)炳星　顧　梅

[摘要] 隨著新型免疫抑制劑的臨床應(yīng)用和血管吻合技術(shù)的提高,臨床肝移植成功率大大提高，而嚴(yán)重肝臟缺血再灌注損傷所引起的移植肝功能受損始終未能解決，影響肝移植的效果。因此本文對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的分類、機(jī)制、預(yù)防及治療等方面予以綜述。

[關(guān)鍵詞] 肝臟；局部缺血；再灌注損傷

[中圖分類號(hào)] R657.3[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]C [文章編號(hào)]1674-4721（2009）05（a）-020-03

The mechanism of hepatic ischemia-reperfusion injury

GUAN Bingxing, GU Mei

(Beijing Tongren Hospital General Surgery,Beijing100730,China)

[Abstract] With the new immunosuppressive agents and the clinical application of vascular anastomosis techniques improved the success rate of clinical liver transplantation greatly improved. And severe hepatic ischemia-reperfusion injury caused by impaired liver function has not yet been resolved, the effect of the impact of liver transplantation. So this article on hepatic ischemia-reperfusion injury classification, mechanism, prevention and treatment to be summarized.

[Key words] Liver；Ischemic；Reperfusion injury

肝移植相關(guān)的缺血再灌注損傷是指從正常體溫下，心臟停跳開始到供肝植入受體內(nèi)，重新建立起血循環(huán)的全過程中，在任何時(shí)間和任何環(huán)節(jié)發(fā)生的肝細(xì)胞損傷。熱缺血損傷指的是肝臟在正常體溫下心臟停跳到冷灌注開始的這段時(shí)間發(fā)生的損傷；冷缺血損傷指的是肝臟在低溫下缺血引起的損傷；再灌注損傷是肝臟在缺血后，恢復(fù)血液供應(yīng)不僅不能使肝功能恢復(fù)，反而肝臟損傷加重的現(xiàn)象。缺血性損傷和再灌注損傷是密切相連的病理生理過程，不能把兩者區(qū)分開來，是連續(xù)的過程。本文為了敘述方便，分別描述各自的病理生理變化。

移植肝缺血再灌注損傷包括熱缺血、冷缺血及再灌注損傷三個(gè)過程。其形成因素是不同溫度下肝臟缺血所致。熱缺血損傷程度主要與熱缺血的時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)；冷缺血損傷程度則與冷保存時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)。因此肝移植相關(guān)的缺血再灌注損傷程度與冷熱缺血時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)。

肝臟缺血再灌注損傷病理生理學(xué)機(jī)制：缺血性損傷和再灌注損傷是密切相連的病理生理過程，不能把兩者區(qū)分開來，是個(gè)連續(xù)的過程。但為了方便，本文將分別敘述在各階段發(fā)生的變化，其中再灌注期的損失占主要地位。主要表現(xiàn)在血液再灌注后因迅速糾正缺血、缺氧及酸中毒情況導(dǎo)致大量氧自由基釋放、Ca²⁺超載以及多種有害因子的釋放導(dǎo)致移植物損傷。

1 熱缺血損傷機(jī)制

肝臟在正常體溫下心臟停跳到冷灌注開始的這段時(shí)間叫熱缺血時(shí)間，這段時(shí)間的長(zhǎng)短極大的影響了移植后肝功能的恢復(fù)。各個(gè)器官耐受熱缺血時(shí)間的長(zhǎng)短有所不同，根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推測(cè)，熱缺血15～20 min為比較安全的時(shí)限[1]，但臨床上有用熱缺血達(dá)30 min肝臟移植后肝功能恢復(fù)良好的患者，但已達(dá)成的共識(shí)是這段時(shí)間越短對(duì)移植肝臟術(shù)后肝功能恢復(fù)越好。熱缺血期的病理生理變化及其可能機(jī)制：

1.1代謝性酸中毒

肝臟在常溫下即熱缺血時(shí)，各種代謝底物和氧的供應(yīng)中止，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的能量很快耗盡，無氧酵解的發(fā)生和肝細(xì)胞內(nèi)ATP 迅速耗盡，導(dǎo)致乳酸、酮體等的堆積以及線粒體氧化磷酸化功能低下，引發(fā)代謝性酸中毒，pH 值降低，但pH 值降低抑制了磷脂酶、蛋白水解酶等pH 依賴性酶類活性，減少其對(duì)細(xì)胞的損傷，從而能保護(hù)肝細(xì)胞和其他細(xì)胞免于壞死。

1.2 線粒體損傷

線粒體是細(xì)胞氧化磷酸化反應(yīng)的主要部位，肝臟熱缺血時(shí)ATP含量減少，Ca²⁺進(jìn)入線粒體增多，使線粒體功能受損，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，以致進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的O2 經(jīng)單電子還原而形成的氧自由基增多。在機(jī)體內(nèi)氧自由基可對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪及核酸等幾乎所有生物活性物質(zhì)均具有損傷作用[2]。

1.3鈣超載

正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺濃度存在著較大的梯度，細(xì)胞內(nèi)低的Ca²⁺濃度是維持細(xì)胞正常生理機(jī)能的前提，各種原因引起的細(xì)胞內(nèi)鈣含量異常增多并導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損和功能代謝障礙的現(xiàn)象稱為鈣超載。缺氧使ATP 含量下降，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)外Ca²⁺重新分布，即Ca²⁺內(nèi)流。鈣超載引起肝損傷的機(jī)理有以下幾個(gè)方面，細(xì)胞內(nèi)高濃度Ca²⁺可促使黃嘌呤脫氫酶向黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化，從而為氧自由基的產(chǎn)生提供了催化劑。Kupffer 細(xì)胞的鈣超載是其被激活的根本原因，激活的Kupffer 細(xì)胞可通過釋放大量毒性介質(zhì)而參與或介導(dǎo)肝臟損傷[3-4]。

以上的缺血損害在一定時(shí)間內(nèi)是可逆的，但超過一定限度將導(dǎo)致不可逆損害。35～37℃下器官能耐受的熱缺血時(shí)間極短，故降低溫度是成功保存器官的關(guān)鍵。

2 冷缺血（保存）損傷機(jī)制

供體器官經(jīng)低溫灌注降到一定的溫度后，還必須經(jīng)歷一個(gè)冷缺血保存過程才能進(jìn)行移植。不同器官可耐受的缺血時(shí)間也不同。影響器官保存的因素很多：包括保存液的配方、滲透壓的高低、器官的降溫、維持和恢復(fù)以及器官的保存方式等。低溫可延長(zhǎng)組織的存活時(shí)間，是保存成功的關(guān)鍵因素，但同時(shí)低溫也會(huì)對(duì)器官組織的正常功能產(chǎn)生很大影響。主要機(jī)制如下：低溫抑制ATP酶的活性，胞質(zhì)膜電位差降低，Ca²⁺通過質(zhì)膜通道、Na+-Ca²⁺交換，膜通透性改變順離子濃度梯度等方式內(nèi)流進(jìn)入細(xì)胞。低溫致ATP消耗，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵失活，釋放出大量Ca²⁺，發(fā)生細(xì)胞內(nèi)有害的Ca²⁺再分配，同時(shí)低溫?zé)o氧糖酵解產(chǎn)生乳酸堆積，細(xì)胞內(nèi)酸中毒使鈣蛋白結(jié)合的鈣游離為Ca²⁺，胞質(zhì)和線粒體中鈣超載，破壞了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，氧化磷酸化功能喪失，ATP合成障礙，胞內(nèi)鈣超載可激活磷脂酶C、磷脂酶A2，破壞膜磷脂，還可激活蛋白酶，促使黃嘌呤脫氫酶（XD）轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶（XO），再灌注時(shí)產(chǎn)生氧自由基加劇細(xì)胞損傷。主要作用目前認(rèn)為在冷保存期間肝臟的主要變化包括細(xì)胞水腫，氧自由基、溶酶體酶等有害因子的釋放， 細(xì)胞內(nèi)Na+、Ca²⁺超載。這些因素共同導(dǎo)致冷缺血期肝細(xì)胞的損傷[1]，見圖1。

3再灌注損傷機(jī)制

再灌注損傷與自由基的產(chǎn)生，鈣超載的作用，中性粒細(xì)胞的聚集，內(nèi)皮素（ET）/ 一氧化氮（NO）的失衡，核因子-κB (NF-κB) 的激活，前炎性細(xì)胞因子(proinflammatory cytokine) 和黏附因子的釋放等因素密切相關(guān)。其中氧自由基的損害作用最大，將分別予以闡述。

3.1 氧自由基

氧自由基是一種由O₂誘發(fā)的在外層電子軌道上含有單個(gè)未配對(duì)電子的化學(xué)物質(zhì)，其具有高度不穩(wěn)定性，它們包括超氧化物自由基、過氧化氫、氫氧根，主要來源于細(xì)胞質(zhì)黃嘌呤氧化酶、Kupffer 細(xì)胞、黏附的中性粒細(xì)胞。在機(jī)體內(nèi)氧自由基可對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪及核酸等幾乎所有生物活性物質(zhì)均具有損傷作用。

再灌注時(shí)主要通過以下途徑激發(fā)氧自由基。①黃嘌呤氧化酶系統(tǒng): 細(xì)胞缺血低氧時(shí)，由于能量代謝障礙，造成細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺濃度增高，進(jìn)而活化鈣依賴蛋白酶，后者可催化黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，再灌注時(shí)黃嘌呤氧化酶促使次黃嘌呤分解為尿酸的同時(shí)而產(chǎn)生氧自由基。②吞噬細(xì)胞系統(tǒng):激活的Kupffer 細(xì)胞及黏附于肝竇內(nèi)的白細(xì)胞可產(chǎn)生膜相關(guān)的NADPH 氧化酶，后者可將胞漿內(nèi)的HADPH 氧化成NADP+，并將產(chǎn)生的3個(gè)電子傳遞給氧，從而生成超氧化物基團(tuán)。③線粒體呼吸鏈:正常生理下，細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈能產(chǎn)生微量的超氧化物基團(tuán)及H₂O₂，但細(xì)胞的缺血低氧可放大線粒體的這種功能， 從而產(chǎn)生大量的超氧化物[5]。

氧自由基的主要損傷作用在于：①細(xì)胞膜雙層脂質(zhì)進(jìn)行氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物（LPO），直接損傷細(xì)胞；②損傷細(xì)胞器膜，引起細(xì)胞器破裂；③引起細(xì)胞損傷，釋放各種酶及細(xì)胞因子，細(xì)胞因子可以接到中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮素聚集黏附，造成微循環(huán)障礙。氧自由基可氧化漿膜，改變膜的流動(dòng)性和通透性，氧化含巰基的酶而使酶失活，氧化核酸，使DNA雙鏈斷裂，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生血小板激活因子（PAF）、白三烯、血栓素和前列腺素等炎性介質(zhì)和TNF、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子，加劇內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并趨化血小板、白細(xì)胞黏附、聚集，血液凝集性增高，導(dǎo)致組織損傷進(jìn)一步加重[1]。

3.2 中性粒細(xì)胞

中性粒細(xì)胞在肝臟缺血再灌注損傷的早期聚集到肝臟微循環(huán)系統(tǒng)中被活化，加重再灌注損傷。中性粒細(xì)胞的聚集外侵需要肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之間的相互作用，通過中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子（ICAM-1）的上調(diào)使得兩者的結(jié)合更加緊密，從而使中性粒細(xì)胞進(jìn)一步越過內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入肝臟實(shí)質(zhì)，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)；另一方面，中性粒細(xì)胞黏彈性較大，流經(jīng)微循環(huán)所需時(shí)間較長(zhǎng)，缺血再灌注壓下降，中性粒細(xì)胞可以堵塞微血管造成無復(fù)流現(xiàn)象。有研究認(rèn)為，肝竇是中性粒細(xì)胞外侵的主要地方，一旦外侵入肝實(shí)質(zhì)，中性粒細(xì)胞通過淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原與肝細(xì)胞上的細(xì)胞間黏附分子結(jié)合發(fā)生作用，引起長(zhǎng)時(shí)間的蛋白酶的釋放和氧化應(yīng)激，造成肝臟的損傷[5]，損傷的內(nèi)皮可吸引中性粒細(xì)胞及血小板，促進(jìn)其釋放化學(xué)趨化介質(zhì)如白三烯、B4、PAF等，進(jìn)一步促進(jìn)黏附，造成毛細(xì)血管堵塞和無復(fù)流。

3.3 Kupffer 細(xì)胞

Kupffer 細(xì)胞是位于肝血竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞，肝臟缺血再灌注后Kupffer 細(xì)胞可被激活，該細(xì)胞被激活后產(chǎn)生氧自由基和大量炎癥介質(zhì),其中以TNF和IL-1作用最強(qiáng)。它們可直接造成肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最重要的作用在于其介導(dǎo)的鏈?zhǔn)綋p傷反應(yīng)：①引起肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，刺激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子高表達(dá)；②刺激肝竇內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放一氧化氮和內(nèi)皮素；③激活中性粒細(xì)胞釋放氧自由基，中性粒細(xì)胞在黏附分子的作用下與血管內(nèi)皮黏附聚集，引起內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)一步損傷和肝臟微循環(huán)障礙；④介導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生多核中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子，最中性粒細(xì)胞在肝組織中游走和損失肝細(xì)胞起重要作用。有研究表明，在肝缺血再灌注損傷中，Kupffer細(xì)胞被激活產(chǎn)生細(xì)胞因子引起的鏈?zhǔn)綋p傷反應(yīng)，從不同環(huán)節(jié)進(jìn)行阻斷可以減輕和預(yù)防肝損傷[6]。

3.4細(xì)胞因子

多種細(xì)胞因子參與了肝臟缺血再灌注損傷的病理生理過程，例如TNF-α、PAF (血小板激活因子)、IL-1 、IL-10 等。這些細(xì)胞因子可以通過自分泌、旁分泌以及體液途徑在肝內(nèi)彼此間形成網(wǎng)絡(luò)、協(xié)同作用，進(jìn)而引起肝損傷。TNF-α作用在于：①可激活T、B 淋巴細(xì)胞并增強(qiáng)它們的細(xì)胞毒性作用，又可誘導(dǎo)和上調(diào)細(xì)胞間細(xì)胞黏附分子和血管細(xì)胞黏附分子，從而促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。②加強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞MHCI 類抗原的表達(dá)，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生PAF、IL-1 等炎性介質(zhì)，并激活白細(xì)胞，促進(jìn)血栓形成。③間接損害線粒體并可激發(fā)Kupffer 細(xì)胞產(chǎn)生過氧化物殘基，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-1、IL-6 、IL-8 等細(xì)胞因子，加重再灌注后移植肝損害[7] 。IL-1可誘導(dǎo)IL-8的合成并增加細(xì)胞黏附分子選擇素、整合素的表達(dá)，這些均增強(qiáng)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，進(jìn)一步導(dǎo)致合成更多的細(xì)胞因子；PAF 可激活黏附于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基。IL-10 是一種抗炎細(xì)胞因子，它可以通過抑制NF-κB 的活性減輕炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，IL-10 能抑制TNF-α及細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而減輕肝臟缺血再灌注損傷導(dǎo)致的微循環(huán)障礙。

3.5一氧化氮(NO) 和內(nèi)皮素( ET)

再灌注時(shí)NO 和ET 水平失衡是肝臟再灌注損傷的一個(gè)重要因素。NO 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌的介質(zhì)。①它舒張血管能直接影響機(jī)體特異和非特異性免疫，尤其在器官移植缺血再灌注損傷中，引起具有調(diào)節(jié)血管張力、調(diào)節(jié)微循環(huán)、抑制血小板聚集，抑制白細(xì)胞的粘附的作用[8-9]。②與O₂結(jié)合成過氧亞硝酸鹽釋放自由基，引起肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷。ET是一種來源于內(nèi)皮細(xì)胞并具有廣泛生物學(xué)活性的多肽類物質(zhì)，它可以通過激活磷脂酶及細(xì)胞膜離子通道從而收縮血管，血管收縮效應(yīng)對(duì)ET 具有劑量依賴性，在肝臟缺血再灌注過程中，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞合成及分泌ET 的能力明顯增強(qiáng)。這可能是因?yàn)橐环矫娴脱跫鞍麧{內(nèi)Ca²⁺濃度升高可促使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ET，另一方面在再灌注短期內(nèi)，由門靜脈進(jìn)入肝臟內(nèi)的腸源性內(nèi)毒性也可刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ET。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟再灌注時(shí)期ET 濃度顯著增高而NO濃度則明顯降低，二者濃度失衡是肝臟缺血再灌注損傷微循環(huán)障礙的一個(gè)重要原因[10]。應(yīng)用內(nèi)皮素受體阻滯劑可使缺血再灌注損傷減輕。

4前景

為了延長(zhǎng)移植器官存活期，基因治療主要起兩方面的作用：①抑制排斥免疫反應(yīng)；②增強(qiáng)移植器官保護(hù)功能。主要作用在第一方面，但這種機(jī)制也包括一些非免疫機(jī)制，這些非免疫機(jī)制是缺血再灌注后局部炎性反應(yīng)和隨后組織修復(fù)的結(jié)果。它包括兩個(gè)方面：①抗氧化應(yīng)激反應(yīng)移植細(xì)胞或器官早期非免疫性失活的一個(gè)重要原因是缺氧和再灌注損傷，缺血再灌注損傷激起氧自由基的產(chǎn)生。氧自由基會(huì)引起細(xì)胞因子的生成和白細(xì)胞聚集，導(dǎo)致移植器官細(xì)胞死亡。氧化應(yīng)激還增加移植器官隨后發(fā)生急性和慢性排斥反應(yīng)的機(jī)會(huì)。最近已經(jīng)用轉(zhuǎn)基因的方法在肝臟中證實(shí)了氧化應(yīng)激在器官移植缺血再灌注損傷中的作用。在這個(gè)研究中，用腺病毒做轉(zhuǎn)基因載體使肝細(xì)胞產(chǎn)生大量表達(dá)線粒體超氧化物歧化酶，減少了缺血再灌注后干細(xì)胞的損傷。這和移植了氧化還原反應(yīng)激活NF-κB和AP1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。這些結(jié)果說明了將抑制氧化還原反應(yīng)的分子轉(zhuǎn)入移植器官可以預(yù)防移植器官失活。②抗凋亡基因。在器官移植基因工程中，讓移植器官大量表達(dá)抗凋亡基因是個(gè)突破口。這不但包括防止發(fā)生于缺血再灌注損傷后的凋亡，而且減少潛在疾病或排斥免疫機(jī)制造成的移植器官實(shí)質(zhì)細(xì)胞死亡。在肝臟缺血再灌注損傷模型中腺病毒轉(zhuǎn)Bcl-2基因防止了肝細(xì)胞損傷和凋亡。在體外實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)抗凋亡基因（Bcl-2，Bcl-xl和A20），不但可以防止凋亡，還可以抑制它們被依賴于核因子κB的機(jī)制激活。NF-κB介導(dǎo)細(xì)胞因子和氧自由基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的激活，導(dǎo)致許多炎性前介質(zhì)的產(chǎn)生，損害移植器官功能。

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(收稿日期：2009-04-08)