２２０例無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者遺傳學(xué)分析

鄂　偉　韓維田　郭廷超

【摘 要】 目的:檢查無(wú)精子、嚴(yán)重少精子患者的染色體異常和Y染色體上無(wú)精子基因(AZF)微缺失的遺傳缺陷。 ┓椒ǎ河τ猛庵苧培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，對(duì)220例無(wú)精子、嚴(yán)重少精子患者的染色體和11個(gè)AZF基因位點(diǎn)進(jìn)行檢查。結(jié)果：在140例無(wú)精子患者中，發(fā)現(xiàn)19例患者染色體異常，異常率為13.57%。有21例患者有AZF基缺失，總?cè)笔蕿?0.31%，AZFa、AZFb、AZFc缺失率分別為2.38%、4.76%、16.67%。在80例嚴(yán)重少精子患者中，有14例患者有AZF基因缺失，總?cè)笔蕿?7.50%，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分別為1.25%和17.50%。未發(fā)現(xiàn)有染色體異常和AZFa缺失。結(jié)論：染色體異常和無(wú)精子基因微缺失是導(dǎo)致無(wú)精子癥、少精子癥主要因素，遺傳學(xué)檢查對(duì)男性不育患者的病因診斷與治療有著重要價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 不育癥； 男性； Y染色體； AZF； 無(wú)精子癥； 少精子癥

已婚育齡夫婦不孕癥的發(fā)病率高達(dá)10%~15%，其中男性不育約占40%，特發(fā)性無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子是男性不育的主要類(lèi)型。引起無(wú)精子或嚴(yán)重少精子的原因極其復(fù)雜，遺傳缺陷是其中的重要原因之一。男性無(wú)精子和嚴(yán)重少精子患者除染色體異常外，Y染色體長(zhǎng)臂有控制精子生成的無(wú)精子因子（Azoospermia factor，AZF），這一區(qū)域的基因微缺失與無(wú)精子和嚴(yán)重少精子密切相關(guān)。我們通過(guò)對(duì)無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子患者外周血染色體和Y染色體上AZF缺失的檢測(cè)，探討了引起無(wú)精子和少精子的遺傳因素和AZF缺失與表型效應(yīng)的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

來(lái)自我院不育門(mén)診就診的男性不育患者。根據(jù)世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析、果糖測(cè)定、精液脫落細(xì)胞學(xué)檢查等，并排除繼發(fā)感染、輸精管缺如、其它睪丸外傷等病癥，經(jīng)確診為無(wú)精子或嚴(yán)重少精子病例作為研究對(duì)象。無(wú)精子癥140例，嚴(yán)重少精子患者80例。按設(shè)計(jì)表格逐一填寫(xiě)個(gè)人一般狀況、個(gè)人發(fā)育史、生育史、既往病史、體格檢查等情況。無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子病例年齡22~40歲，平均29.03±3.35歲 。以我院優(yōu)生門(mén)診和沈陽(yáng)市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科有正常生育史患者的丈夫30例為對(duì)照組，以10例正常女性為陰性對(duì)照組，年齡24~35歲，平均28.12±2.83歲。

1.2 方 法

1.2.1 精液分析

根據(jù)世界衛(wèi)生組織精液評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，每例患者重復(fù)兩次以上檢測(cè)，留取標(biāo)本前應(yīng)禁欲3~5天。無(wú)精子患者，經(jīng)連續(xù)三次精液分析，并經(jīng)離心沉淀均無(wú)精子者確診為無(wú)精子癥，并排除繼發(fā)感染、輸精管缺如、其它睪丸外傷等病癥。精子密度低于5×10⁶/ml為嚴(yán)重少精子癥。

1.2.2 激素測(cè)定

采用SEROZYME I 磁分離酶聯(lián)免疫測(cè)試儀（瑞士）測(cè)定血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、睪酮（T）激素，試劑為SEROZYME專(zhuān)用進(jìn)口試劑。

1.2.3 染色體檢查

采用本室常規(guī)外周血染色體檢查方法，鏡下每例計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，G染色體顯帶核型分析5個(gè)。

1.2.4 Y染色體上缺失基因檢測(cè)

1.2.4.1 無(wú)精子基因引物

根據(jù)文獻(xiàn)資料，在Y染色體長(zhǎng)臂5~6區(qū)30個(gè)基因片段位點(diǎn)分別選擇了引物AZFa區(qū)sY84、sY86，AZFb區(qū)sY102、sY134，AZFc區(qū)sY147、sY153、sY157和RBM，引物由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所合成。它們的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA長(zhǎng)度分別為326bp、320bp、218bp、301bp、100bp、139bp、285bp 和825bp。

1.2.4.2 PCR反應(yīng)檢測(cè)分析 1）標(biāo)本DNA提?。翰杉颊咄庵苎?ml，肝素抗凝，3000 rpm離心20min，取白細(xì)胞層加入等量的裂解緩沖液，充分混懸。15000rpm離心3min，去上清，沉淀加入1ml裂解液，重復(fù)1~2次，常規(guī)法提取DNA備用。

2）反應(yīng)條件：25μl反應(yīng)體系100 μl 10×緩沖液（10mM Tris-HCl，pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂），8μl dNTP混合物（每種核苷酸12.5mM），DNA聚合酶8μl（5UI/μl ），引物濃度按每反應(yīng)體系50pmol加入超純水295μl；混合后分裝每反應(yīng)管22μl，加入模板DNA3μl 。在PE480PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。94℃預(yù)變性5min，94℃30sec，54℃45sec，65℃120sec，共完成45個(gè)循環(huán)，最后65℃5min延伸，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置4℃冰箱中儲(chǔ)存。3)產(chǎn)物檢測(cè)分析：

每PCR反應(yīng)管中加入載樣緩沖液3μl，吸取10μl加樣,用3%瓊脂糖凝膠（含0.5μg /ml，溴化乙啶）電泳，電壓8伏/cm，在紫外透射儀下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 染色體分析

在140例無(wú)精子患者中，發(fā)現(xiàn)19例患者染色體異常，異常率為13.57%，其中47，XXY14例，46，XY，del（Yq12）2例，46，XY，del（Yq）1例，46，XY，inv（9）2例。此外還發(fā)現(xiàn)4例患者Y染色體長(zhǎng)臂明顯增大。80例嚴(yán)重少精子患者中未發(fā)現(xiàn)有染色體異常。

2.2 無(wú)精子基因檢測(cè)

2.2.1 在140例無(wú)精子患者中，除14例47，XXY患者未做無(wú)精子基因檢查外，其余全部進(jìn)行8個(gè)基因位點(diǎn)的無(wú)精子基因測(cè)定。結(jié)果表明，有21例患者有AZF基因缺失，總?cè)笔蕿?0.31%。其中2例sY84缺失，3例sY86缺失， 5例sY102缺失，6例sY134缺失、6例sY147缺失，15例sY153缺失，16例sY157缺失，4例RBM缺失。缺失率分別為1.59%、2.38%、3.79%、4.76%、4.76%、11.90%、12.70%和3.17%。AZFa、AZFb、AZFc、RBM缺失率分別為2.38%、4.76%、16.67%、3.17%。有3例同時(shí)存在AZFa、AZFb、AZFc缺失，有3例同時(shí)存在AZFb、AZFc缺失，15例為單純AZFc缺失，RBM基因缺失同時(shí)伴AZFc缺失。

2.2.2 在80例嚴(yán)重少精子患者中，有14例患者有AZF基因缺失，總?cè)笔蕿?7.50%。其中AZFb區(qū)域1例sY102和sY134缺失，AZFc區(qū)域5例sY147缺失、11例sY153缺失、12例sY157缺失，1例RBM缺失。缺失率分別為1.25%、1.25%、7.50%、13.75%、15.00%、2.50%。未發(fā)現(xiàn)AZFa區(qū)域的sY84和sY86s缺失，AZFb和AZFc的基因片段缺失率分別為1.25%和17.50%。

2.2.3 30例正常對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)8種基因片段缺失；10例女性對(duì)照，8種引物未擴(kuò)增出產(chǎn)物。

2.3 無(wú)精子癥患者精漿脫落細(xì)胞檢查

在126例無(wú)精子癥患者中，有23例患者檢查到有生精細(xì)胞，103例未見(jiàn)到生精細(xì)胞，21例AZF缺失患者中有4例精液中有生精細(xì)胞，占19.05%；105例無(wú)AZF缺失患者中有19例精液中有生精細(xì)胞，占18.09%。兩者無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 睪酮、黃體生成素、促卵泡刺激素水平

患者血清中T、LH、FSH激素平均濃度均在正常范圍，無(wú)精子癥患者血清中T、LH、FSH分別為（4.11±1.05）ng/ml、（9.91±6.23）mIU/ml、（10.27±8.25）mIU/ml；嚴(yán)重少精子癥患者血清中分別為（6.48±2.26）ng/ml、（10.45±5.61）mIU/ml 、（15.02±11.23）mIU/ml；AZF缺失患者分別為（5.04±1.34）ng/ml、（11.21±6.81）mIU/ml、（10.52±8.47）mIU/ml。除無(wú)精子癥T濃度明顯低于嚴(yán)重少精子癥（P<0.05)外，嚴(yán)重少精子癥、無(wú)精子癥和基因缺失患者血清中的FSH、LH濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

引起無(wú)精子和嚴(yán)重少精子的原因很多，遺傳物質(zhì)改變是其中主要因素，其中染色體異常約10%~15%，主要以47，XXY占絕大多數(shù)，還有一些結(jié)構(gòu)異常，包括常染色體和性染色體。但是，性染色體數(shù)目異常和Y染色體與常染色體易位均表現(xiàn)有第二性征改變，常染色體和Y染色體部分缺失、增加一般副性征正常。本文無(wú)精子患者染色體異常發(fā)生頻率為13.57%，與文獻(xiàn)報(bào)道[1]相吻合。

自從Tiepolo[2]等人首次發(fā)現(xiàn)Y染色體長(zhǎng)臂熒光區(qū)缺失的病人精子生成障礙后，一些學(xué)者對(duì)AZF的基因定位、構(gòu)成和遺傳效應(yīng)進(jìn)行了大量的研究。Vergnaud[3]應(yīng)用Y染色體DNA探針建立了人類(lèi)Y染色體基因圖譜，將Y染色體分為7個(gè)區(qū)，長(zhǎng)臂為5、6、7區(qū)。Ma[4]對(duì)50例無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥缺失部分進(jìn)行DNA探針篩查時(shí)發(fā)現(xiàn)4例6區(qū)缺失，且不重疊，揭示AZF是一個(gè)基因家族。并首先提出RBM（最初稱(chēng)YRRM）是無(wú)精子生成基因的候選基因。Vogt等[5]證實(shí)無(wú)精子因子（AZF）位于Yq11的第5、6區(qū)，這兩個(gè)區(qū)域有較多的控制精子發(fā)生的基因片段，分為AZFa、AZFb、AZFc三個(gè)區(qū)。目前資料報(bào)道，在無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的患者中，有AZF缺失的約占3%~29%，它是染色體異常導(dǎo)致的無(wú)精子以外的第二個(gè)重要因素。

在我們的研究中，126例無(wú)精子癥有21例患者有AZF基因缺失，以AZFc缺失最多，缺失率高達(dá)16.67%。AZFa、AZFb、RBM缺失率較低，而且均伴有AZFc缺失。80例嚴(yán)重少精子患者中有14例患者有AZF基因缺失，主要以AZFc缺失為主，缺失率為17.50%，AZFb基因片段缺失僅為1.25%，而且未發(fā)現(xiàn)AZFa區(qū)域缺失。所以，Yq11的AZFb、AZFc區(qū)域的微基因缺失是引起無(wú)精子和嚴(yán)重少精子的主要原因。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥中多數(shù)病例同時(shí)微缺失2個(gè)以上基因片段，說(shuō)明AZF是個(gè)多基因的大家族，有許多不育基因與之有關(guān)。以往報(bào)道RBM基因族是無(wú)精子和嚴(yán)重少精的主要候選基因，RBM在AZFb區(qū)內(nèi)，它的缺失對(duì)精子發(fā)生有影響。我們的結(jié)果是無(wú)精子中RBM缺失率僅占3.17%，而且，同時(shí)伴有AZFc缺失。本研究AZFa缺失很少，與以前報(bào)道的無(wú)精子與AZFa缺失有關(guān)不大一致，而主要是AZFc缺失,盡管我們對(duì)這個(gè)區(qū)域檢測(cè)的數(shù)量有限，但也提示AZFc區(qū)域的缺失導(dǎo)致生精障礙要比AZFb和AZFa區(qū)域缺失更常見(jiàn)，也有類(lèi)似文獻(xiàn)報(bào)道[6]。

文獻(xiàn)資料表明[7]，睪酮是睪丸間質(zhì)Leydig細(xì)胞產(chǎn)生的，除維持男性第二性征和性功能的作用外，睪酮分泌減少將導(dǎo)致精子發(fā)生減緩。FSH主要促進(jìn)精子生成和成熟，在青春期FSH可促進(jìn)睪丸重量增加和曲細(xì)精管直徑增大。LH可刺激Leyig細(xì)胞合成和分泌睪酮，并將睪酮直接通過(guò)間質(zhì)細(xì)胞作用于生精上皮細(xì)胞。我們對(duì)患者血清中激素水平測(cè)定結(jié)果表明，除無(wú)精子癥睪酮明顯低于嚴(yán)重少精子患者外，無(wú)精子、少精子和基因缺失患者的LH、FSH等激素水平均沒(méi)有明顯差異，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因缺失與激素變化的關(guān)系。

Vogt[5]等并通過(guò)病人的睪丸組織分析發(fā)現(xiàn)，AZF基因缺失在同一區(qū)域，精子發(fā)生受阻也在同一時(shí)期。AZFb缺失表現(xiàn)為生殖細(xì)胞成熟障礙，睪丸內(nèi)只見(jiàn)精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，精液中無(wú)精子。AZFc的表現(xiàn)有兩種，可見(jiàn)精原、精母、精細(xì)胞、精子；僅見(jiàn)支持細(xì)胞，精子數(shù)量減少。我們對(duì)126例無(wú)精子患者進(jìn)行精液脫落細(xì)胞檢查，發(fā)現(xiàn)僅有23例患者檢查到有生精細(xì)胞，103例未見(jiàn)到生精細(xì)胞，而且AZF缺失患者中有生精細(xì)胞人數(shù)和無(wú)AZF缺失患者中有生精細(xì)胞人數(shù)兩者無(wú)顯著差異。因此，AZF微缺失與無(wú)精子或少精子患者的表型效應(yīng)關(guān)系需進(jìn)一步探討。

我們的研究支持AZF區(qū)域微缺失與無(wú)精子之間有著因果關(guān)系，尤其是AZFc區(qū)的缺失的報(bào)道[8]。但是，大部分精子生成障礙尚未檢查出原因，可能受Yq11缺失多個(gè)基因位點(diǎn)影響，我們僅檢測(cè)了部分基因片段。此外，AZF的點(diǎn)突變也可能對(duì)精子生成有影響。因此，有關(guān)精子生成基因的課題尚待深入研究。鑒于染色體異常和AZF微缺失與無(wú)精子、少精子關(guān)系密切，遺傳學(xué)檢查對(duì)男性不育患者的病因診斷有著重要價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

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［收稿日期：2009-03-16］