海藻多糖的提取、分離純化 與應(yīng)用研究進(jìn)展

劉 歡,陳勝軍,楊賢慶

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306)

海藻(Sargassum),海產(chǎn)藻類的統(tǒng)稱,通常固著于海底或某種固體結(jié)構(gòu)上,是基礎(chǔ)細(xì)胞所構(gòu)成的單株或一長串的簡單植物。近年來,隨著海藻養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展,世界上約有50個國家正在進(jìn)行以海藻占絕大多數(shù)(按重量計)的水生植物養(yǎng)殖,其中以海帶、麒麟菜、裙帶菜、紫菜居多,產(chǎn)量基本上呈逐年增長趨勢。根據(jù)2016年世界糧農(nóng)組織報道,2014年全世界共收獲了約2850萬噸的海藻和其他藻類,用于食品(日本、韓國和中國等)、藥品及農(nóng)業(yè)等方面。人們越來越關(guān)注一些富含天然維生素、礦物質(zhì)和植物蛋白的海藻物種的營養(yǎng)價值。海藻口味的許多食品(包括冰淇淋)和飲料在全球有廣闊的市場前景[1]。中國作為海藻養(yǎng)殖大國,海藻產(chǎn)品產(chǎn)量由穩(wěn)步增長到快速增長,到2015年,藻類產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)212.43萬噸,海藻產(chǎn)品生產(chǎn)主要集中在福建、山東、遼寧及廣東地區(qū)。海藻產(chǎn)品以海帶為主,約占70%,其他品種占比依次為裙帶菜10%、紫菜6%、江蘺13%、其他1%[2]。海藻是一種營養(yǎng)成分豐富的水生植物,主要的活性物質(zhì)有多酚、多糖、蛋白質(zhì)、脂類、維生素和礦物質(zhì),其中海藻多糖含量最高能達(dá)到76%(按干重計)[3],研究價值高。

海藻多糖是從海藻中提取出的多組分混合物,是一種由多個相同或不相同的單糖基通過糖苷鍵相連而成的高分子碳水化合物,依據(jù)來源可分為4大類,即褐藻多糖、紅藻多糖、綠藻多糖以及藍(lán)藻多糖[4]。海藻多糖因其凝膠性、穩(wěn)定性、成膜性等多種特性,以及抗病毒、抗凝血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化[5]等多種生物活性,現(xiàn)已成為食品、保健醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域的研究熱點。因此,本文就目前國內(nèi)外有關(guān)海藻多糖的提取、分離純化以及應(yīng)用現(xiàn)狀展開綜述,以期為海藻多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 海藻多糖的提取

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法包括水提法、酸提法、堿提法等。閔玉濤等[6]用水提法提取海藻多糖,條件為80 ℃、pH7.0、提取10 h,海藻多糖得率可達(dá)7.8%。該法經(jīng)濟(jì)便捷,操作簡便,但需要多次浸提,較其他方法耗時長,所需溫度較高,且多糖提取效率低。周裔彬等[7]研究了酸法提取海帶多糖的最佳工藝,即:提取溫度75 ℃,時間為4 h,料液比為1∶20 (w/v,0.1 mol/L鹽酸),最終沉淀所用乙醇的濃度為85%。經(jīng)測定,多糖得率為35.1%,為傳統(tǒng)法(2.98%)的11.78倍。堿提法提取海藻多糖,提取率高于水提法,但是會使多糖活性降低[8]。溶劑提取法是海藻多糖較為常見的提取方法,但具有提取率低、活性損失較大、提取時間長的缺點,限制了海藻多糖的大規(guī)模生產(chǎn)。

1.2 物理強(qiáng)化法

物理強(qiáng)化法主要通過物理手段破裂細(xì)胞,使細(xì)胞內(nèi)的多糖流出,從而提高多糖得率。主要有微波輔助法、超聲輔助法、反復(fù)凍融法[9]、高壓電脈沖電場提取法[10]等。目前常用的為微波輔助法以及超聲輔助法。微波輔助法能明顯縮短提取時間,提高效率,并能有效的提高多糖得率。唐志紅等[11]用微波法來提取羊棲菜多糖,在最佳工藝參數(shù)下水溶性羊棲菜多糖的提取率為15.58%,比熱水浸提法提高43.3%,提取時間較傳統(tǒng)熱水浸提法縮短95.37%。王懷玲等[12]采用單因素考察和正交實驗方法優(yōu)化超聲方法提取瓊枝麒麟菜多糖(EGP),超聲30 min,EGP得率為40.3%±1.8%,為傳統(tǒng)熱提法的1.4倍。超聲法提取海藻多糖具有時間短,工藝穩(wěn)定,提取率高的優(yōu)點。總的來說,物理強(qiáng)化法提取海藻多糖,能有效的提高多糖得率,縮短提取時間,節(jié)約資源,但由于超聲、微波等設(shè)備不適用于大規(guī)模生產(chǎn),限制了物理強(qiáng)化法在海藻多糖提取中的發(fā)展。

1.3 酶解法

酶解法包括單一酶解法和復(fù)合酶解法。Hardouin等[13]用酶解法提取石莼多糖,與空白對照相比,經(jīng)過酶C4(β-1,3(4)-葡聚糖外切酶)、酶P1(中性內(nèi)切酶)以及酶P2(中性和堿性內(nèi)切蛋白酶的復(fù)合酶)處理過的石莼,多糖得率分別提高了60%,73%和100%。翟為等[14]以海帶為原料,用復(fù)合酶(纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、木聚糖酶)法提取海帶多糖。在最佳工藝條件下,海帶多糖得率為78.9%,較傳統(tǒng)工藝提高了近3倍。酶解方法能有效降低提取溫度,節(jié)能高效等優(yōu)點。但酶解法提多糖有其局限性,對實驗設(shè)備的要求較高,同時還需綜合考慮酶濃度、底物濃度、抑制劑以及最適pH、溫度等因素。

1.4 復(fù)合法

將多種方法結(jié)合提取多糖,能大大加速多糖的溶出,通過工藝優(yōu)化達(dá)到最優(yōu)的提取效果。劉楊等[15]研究了超聲輔助酸提取、超聲輔助堿提取、超聲輔助水提取3種方法對雨聲紅球藻多糖(Haematococcus pluvialis)提取效率的影響。結(jié)果表明,3種提取方法所得多糖提取率高低依次為:超聲輔助堿提法(9.52%)>超聲輔助酸提法(1.50%)>超聲輔助水提法(1.29%)。超聲輔助堿提法比堿提法(1.55%)的多糖提取率高出近6倍,是一種很好的提取藻類多糖的方法。

超聲波與酶解復(fù)合法是較為常用的提取多糖方法。超聲波協(xié)同酶解法提取綜合了這兩項技術(shù)的優(yōu)點,具有省時、低耗、高產(chǎn)等優(yōu)點。張丹鶴等[16]研究得到超聲波輔助酶法提取馬尾藻多糖的最佳條件,實驗結(jié)果表明,超聲波-酶解法提馬尾藻多糖,多糖含量明顯高于單獨(dú)酶解法。張勝幫等[17]分別用超聲波-酶解法和超聲波法提取裙帶菜多糖,并比較了這兩種方法提取的裙帶菜多糖對羥自由基清除活性的作用。結(jié)果表明,超聲-酶解法的裙帶菜多糖提取效果和及其羥自由基清除率能力明顯優(yōu)于超聲波法。

2 海藻多糖的分離純化

在提取海藻多糖的過程中,常有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)混雜在多糖中,降低了多糖的純度。因此,先要除去蛋白質(zhì)、色素以及一些小分子物質(zhì)。再進(jìn)行進(jìn)一步的純化,對多糖組分進(jìn)行分級,以提高多糖純度。

2.1 除雜

海藻粗多糖中?；煊械鞍踪|(zhì)、色素及一些小分子物質(zhì)。為了得到純多糖,需要除去這些物質(zhì)。除蛋白質(zhì)常用的方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶法等。除色素的方法主要為活性炭吸附法、離子交換法和氧化脫色法等。對于無機(jī)鹽、單糖和寡糖等小分子物質(zhì),可以采用透析法、超濾法等[18]。其中,透析法操作簡便,應(yīng)用更為廣泛。除多糖中蛋白質(zhì)及色素的主要方法及其優(yōu)缺點如表1所示。

表1 多糖除蛋白質(zhì)和色素的主要方法及其優(yōu)缺點Table 1 Main methods of removing protein and pigment in polysaccharides and their advantages and disadvantages

2.2 進(jìn)一步純化

提取、除雜后所得粗多糖通常是混合多糖,若要獲得均一性較高的多糖,還需對多糖進(jìn)行分離純化。多糖分離純化的方法有很多,如分步沉淀法、柱層析法、超濾法等,只用一種方法很難得到均一組分,需綜合利用幾種純化方法才能達(dá)到純化的效果。

2.2.1 分步沉淀法 多糖的成分結(jié)構(gòu)和分子量不同,其極性大小不同,在有機(jī)溶劑(如醇或酮)中的溶解度不同,根據(jù)這一原理,可以依此增加醇濃度,從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來[29]。田華[30]通過乙醇分級沉淀,獲得6種繩江蘺多糖(GCP),其中,以20%、40%、50%乙醇沉淀得繩江蘺多糖各組分GCP20、GCP40、GCP50收率較高,分別為25%、20%、10%。此法簡單易行,一次性處理量較大,關(guān)鍵是找出合適組分的溶劑。

2.2.2 柱層析法 柱層析法,又稱色譜分離法?？梢苑譃槔w維素柱層析、離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和柱層析等。其中離子交換柱層析和凝膠柱層析應(yīng)用最為廣泛。離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性粘多糖[29],較常用柱填料型號有DEAE-瓊脂糖(DEAE-Sepharose)、DEAE-纖維素(DEAE-cellulose)以及DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)[25]。凝膠柱層析則需要根據(jù)被分離對象的結(jié)構(gòu)、分子量的大小等綜合考慮,選擇合適的規(guī)格,對于分子量相對較大的多糖常用Sephadex G-100、Sephadex G-200等。離子交換柱層析主要用于將多糖粗提液中的單組份多糖粗分開,通常采用梯度洗脫法。凝膠柱層析用于將離子交換分離得到的復(fù)合組分分開或者脫鹽[31]。Palaniappan等[32]通過熱水浸提法提取尖種礁膜(Monostroma oxyspermum)硫酸多糖,經(jīng)過陰離子交換和凝膠柱層析,得到的硫酸多糖中含有92%的碳水化合物。

為達(dá)到更好的大分子物質(zhì)純化效果,新型填料型號DEAE-Sepharose Fast Flow應(yīng)用于海藻多糖分離純化,純化效果良好。同時,樹脂化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,適于進(jìn)行大量純化[25]。彭雍博等[33]以日本厚葉海帶(Kjellmaniella crassifolia)多糖為原料,采用DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱層析分離純化,得到5個組分(F-0、F-1、F-2、F-3、F-4),各分離組分峰形相對尖銳且對稱,無拖尾現(xiàn)象,分離純化效果良好,僅F-0為流出峰。

2.2.3 超濾法 超濾法是近年來較常用的高效分離技術(shù),它是以截留不同相對分子質(zhì)量的超濾膜為分離媒介,以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動力,選擇性分離不同相對分子質(zhì)量的多糖,對多糖的生物活性成份破壞小。何芳等[34]采用4種不同截留分子量(MWCO)的超濾膜對條斑紫菜多糖(Pyropia yezoensis Polysaccharide,PP)進(jìn)行分離,得到分子量分別為PP1(MW≥100 K)、PP2(MW:50～100 K)、PP3(MW:10～50 K)、PP4(MW:5～10 K)和PP5(MW≤5 K)5種不同分子量的多糖,并對5種多糖進(jìn)行體外抗氧化活性研究。結(jié)果表明:MW在5K以下的PP為主要功效成分,開發(fā)利用價值較大。劉洪超[35]應(yīng)用超濾技術(shù)(分別為100、50、10、5 K),對羊棲菜多糖進(jìn)行分離,并對不同分子量段的羊棲菜多糖(SFPS)進(jìn)行體外抗氧化活性分析,結(jié)果表明:不同分子量段羊棲菜多糖均具有較強(qiáng)抗氧化能力,相對分子量越小其自由基清除能力相對越強(qiáng)。

3 海藻多糖的應(yīng)用

3.1 食品方面

海藻多糖可作為食品供人直接食用,在中國、日本以及南亞各地常以瓊脂為食物。中國的南方各地也將海藻多糖膠視為夏季最適宜的清涼食品。隨著對海藻多糖研究的深入,海藻多糖的應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛。海藻多糖因其良好的溶解性、增稠作用、凝膠性、乳化穩(wěn)定性、安全穩(wěn)定性等,被廣泛的應(yīng)用于飲料、肉制品、糖果等食品加工中,不僅能夠增加食品的功能性,提高營養(yǎng)價值,對于改善食品品質(zhì)也有積極地促進(jìn)作用。同時,海藻多糖可以制成可食性食品薄膜,用于食品包裝。另外,海藻多糖在食品的涂膜保鮮方面也有廣泛的應(yīng)用。

3.1.1 飲料 目前,許多研究以海藻多糖為原料制備飲料。王秀娟等[36]以海帶為主要原材料,采用酶解法提取海帶多糖,研制出海帶多糖飲料,其最佳配方為:海帶多糖提取液濃度50%,柑橘汁濃度10%,檸檬酸濃度0.3%,蘋果香精濃度1.5%。陳達(dá)妙[37]以滸苔多糖為主原料,配以山楂、枸杞等輔助材料制得的飲料,風(fēng)味良好、品質(zhì)穩(wěn)定,同時,具有較好的調(diào)節(jié)2型糖尿病大鼠糖脂代謝作用。

另外,海藻多糖作為食品添加劑在飲料加工方面也起著重要的作用。海藻多糖作為食品添加劑在飲料加工方面的主要功能特性如表2所示。

表2 海藻多糖作為食品添加劑在飲料加工方面的功能特性Table 2 Functional properties of seaweed polysaccharides as food additives in beverage processing

3.1.2 肉制品 海藻多糖可以用在火腿、火腿腸、重組肉制品中,在牛肉及魚肉罐頭制品用也有應(yīng)用。在肉制品中加入海藻多糖,既可以提高肉制品的品質(zhì),增加粘度,賦予其良好的口感,又可以增加肉制品的持水性和柔嫩性,減少營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的損失。

高雪琴[38]將卡拉膠和大豆分離蛋白以及脂肪復(fù)合添加到豬肉餅中,對豬肉餅的出品率、保水率、保油率、質(zhì)構(gòu)以及感官等指標(biāo)均有不同程度的提高。代增英等[39]研究了海藻酸鹽復(fù)配肉制品增稠劑MY-G02對肉丸品質(zhì)的影響,通過感官品評以及TPA全質(zhì)構(gòu)分析,得出MY-G02的最佳添加量為0.3%。

3.1.3 糖果 海藻多糖加入到糖果,可以發(fā)揮穩(wěn)定劑的作用。海藻多糖加入到透明水果軟糖中,可以提高糖果透明度,不粘牙。在一般硬糖中加入海藻多糖,可以使糖果均勻光滑。潘曉麗等[40]研制的牛肉軟糖,以明膠、瓊脂、卡拉膠為主要復(fù)合凝膠劑。瓊脂糖、無花果糖、棉花糖等產(chǎn)品中都加入一定量的瓊脂,增強(qiáng)凝膠性。在制作透明水果軟糖時加入卡拉膠,可以起到增加水果香味,甜度適中,提高穩(wěn)定性的作用[41]。

3.1.4 食品薄膜 海藻多糖具有良好的成膜性,可以用于制備食品薄膜。海藻酸鈣能與其他天然高分子聚合物共混,制作食用薄膜,可以改善海藻酸鈣凝膠性質(zhì)[42]。肖茜等[43]利用海藻酸鈉與普魯蘭多糖、羧甲基纖維素鈉共混制備可食性包裝薄膜,該薄膜抗拉強(qiáng)度高、阻氧性強(qiáng)且致密。

3.1.5 食品涂膜保鮮 目前,許多研究證明海藻多糖具有保鮮效果。有研究表明:海帶多糖復(fù)合溶液(含2%海帶多糖,0.4%殼聚糖,0.2%魔芋葡甘聚糖)用于辣椒的涂膜保鮮,效果最好[44]。郭守軍等研究表明,與蜈蚣藻多糖與卡拉膠復(fù)合涂膜保鮮劑相比,蜈蚣藻多糖涂膜保鮮劑更有利于楊梅的保鮮[45]。Nima等[46]發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉復(fù)合保鮮溶液(12.98 g/L海藻酸鈉+0.25 g/L葵花籽油+11.6 g/L甘油+3 g/L檸檬精油),顯著抑制了微生物的活性,改善了菠蘿的理化性質(zhì)及感官特性。海藻多糖來源廣泛、成本低、安全性高,同時又具有抑菌、抗病毒、抗氧化等活性,是涂膜保鮮技術(shù)重要的原材料,在果蔬、肉制品、魚蝦[47]等食品中均有良好的保鮮效果[48]。

3.1.6 其他 海藻多糖加入到冰淇淋中,能提高冰淇淋的黏度及膨脹率,改善其組織狀態(tài)。海藻多糖在焙烤食品、果凍、乳制品、醬油等產(chǎn)品的生產(chǎn)中也有廣泛的應(yīng)用[49]。

3.2 保健醫(yī)藥方面

海藻多糖具有廣泛的藥理作用,多樣的生物活性,如抗病毒[50]、抗凝血[51]、抗腫瘤[52]、抗氧化[53]等,在保健品行業(yè)有廣泛的發(fā)展前景。在日本,巖藻多糖保健品非常流行。在中國,市面上有一種名為舒通諾的海藻多糖口服液,是新一代逆轉(zhuǎn)血管病變的純天然海洋生物制品。同時也有一些生物公司出售海藻多糖原料或海藻多糖膠囊用于食品、保健品行業(yè),但是純度不一,質(zhì)量參差不齊。

海藻多糖可以應(yīng)用到植物空心膠囊的制備中。張東[54]研究了海藻酸鈉腸溶空心膠囊的制備,并達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。杜云建等[55]以超低黏度海藻酸鈉為主料,羧甲基纖維素(CMC)和卡拉膠組成凝固體系,在最佳優(yōu)化工藝下,即:溶膠溫度為80 ℃,保溫時間為60 min,鈣化液質(zhì)量濃度為5%,干燥溫度為50 ℃,制備出的膠囊成型性好,膠囊壁厚和脆碎性均符合藥用明膠硬膠囊國家標(biāo)準(zhǔn)。

另外,褐藻多糖藥物SPMG作為抗艾滋病新藥,已經(jīng)進(jìn)入了二期臨床研究[56]。從海帶等海藻中分離提取的海藻酸PPS(藻酸雙酯鈉)治療缺血性心血管疾病效果顯著,已廣泛投入臨床應(yīng)用,但是不良反應(yīng)有待解決[57]。褐藻多糖硫酸酯是從海帶中提取的純天然藥物,通過對其藥學(xué)、藥理和毒理進(jìn)行系統(tǒng)研究后,完成了二期臨床實驗,發(fā)現(xiàn)它對治療腎病綜合癥和早、中期慢性腎衰效果顯著[58]。

3.3 化妝品方面

海藻多糖有清除自由基的功效,可以作為抗氧化、抗衰老成分加入到化妝品中。如,滸苔多糖提取物對于ABTS自由基[59]、DPPH自由基和羥基自由基[60]等具有較好的清除能力。有研究表明,滸苔多糖的硫酸化修飾能提高其抗氧化性[61]。海藻多糖可以防輻射[62],可以作為化妝品中的防曬成分,也可以起到抗衰老的作用。海藻多糖具有保濕性。許雷等[63]發(fā)現(xiàn)酶解后的褐藻膠寡糖有良好的保濕性和吸濕性。唐小華[64]以貽貝殼粉和裙帶菜為原料,研制出貽貝殼海藻多糖面膜,保濕效果顯著優(yōu)于蘆薈膠和黃瓜面膜。吳幼青[65]以異枝麒麟菜多糖為原料,設(shè)計并制備了一種O/W型多糖膏霜,具有相對穩(wěn)定、持久的保濕性能。另外,海藻多糖具有降血脂活性,可以添加到減肥制品中,起到瘦身作用。王慧銘等[66]研究了昆布多糖對對大鼠減肥、降血脂的作用,發(fā)現(xiàn)昆布多糖對肥胖大鼠具有明顯的減肥作用。比較昆布多糖與常用的減肥藥賽尼對于小鼠的減肥作用,結(jié)果無顯著性差異。同時,海藻多糖有抑菌作用[67]等,有望成為治療痤瘡、毛囊炎的化妝品活性成分。

4 展望

我國海藻資源豐富,種類繁多,應(yīng)用廣泛。海藻多糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功能活性,具有巨大的開發(fā)潛力。可以應(yīng)用現(xiàn)代加工技術(shù),生產(chǎn)出附加值高的海藻多糖食品、保健品以及化妝品,提高人們的生活質(zhì)量。

雖然,近年來對于海藻多糖的提取、分離純化以及應(yīng)用等方面的研究取得了一些成就。但同時,也存在一些問題。如:多糖提取方法眾多,各有利弊,但目前仍以熱水浸提為主,效率低,時間長;提取及分離純化的方法的差異,對于海藻多糖的結(jié)構(gòu)以及生物活性的影響尚不明確;海藻多糖結(jié)構(gòu)研究主要集中在單糖組成方面,對于多糖的高級結(jié)構(gòu)研究較少;多糖的活性作用機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系尚不明確;海藻多糖的應(yīng)用方面還有待拓展;對于海藻多糖的生物活性的研究很多,但主要以體外實驗為主,缺乏體內(nèi)實驗以及臨床研究。這些都是海藻多糖研究未來要面臨的挑戰(zhàn)。

未來海藻多糖產(chǎn)業(yè)可以加強(qiáng)以下幾個方面的研究。首先,應(yīng)用兩種及其以上的方法,提取海藻多糖,提高多糖的提取率。同時,要加強(qiáng)海藻多糖結(jié)構(gòu)的研究,確定具有生物活性的多糖結(jié)構(gòu),為食品、保健醫(yī)療等行業(yè)的應(yīng)用提供有力參考。另外,海藻多糖種類繁多,分子修飾在海藻多糖的分子修飾研究已經(jīng)逐漸成為研究熱點,可以加強(qiáng)這方面的研究,開發(fā)出更多高效低毒的新型多糖藥物。