力學(xué)因素在體外構(gòu)建組織工程化軟骨中的應(yīng)用

田　甜　章慶國

田甜 綜述，章慶國 審校

[摘要]力學(xué)因素是軟骨組織工程中的重要影響因素之一。近年來的研究表明，力學(xué)作用可以刺激細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，改變?nèi)S支架上培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的新陳代謝，從而促進(jìn)軟骨組織的生長與重建。本文就力學(xué)因素對軟骨細(xì)胞增殖分泌的促進(jìn)、力學(xué)刺激的傳導(dǎo)機(jī)制及生物反應(yīng)器在軟骨組織工程中的應(yīng)用等方面做一綜述。

[關(guān)鍵詞]力學(xué)載荷；軟骨細(xì)胞；力學(xué)信號；生物反應(yīng)器；軟骨組織工程

[中圖分類號]Q813 R318.01 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）03-0405-03

Application of mechanical loading in vitro with constructing tissue-engineered cartilage

TIAN Tian1,ZHANG Qing-guo2

(1.Department of Plastic Surgery, Affiliated Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009,Jiangsu,China; 2.Auricular Reconstructive Center of Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100144, China)

Abstract: Mechanical factor is one of the most important factors in cartilage tissue engineering. Recently,this research study have been revealed that mechanical loading can stimulate the release of extracellular matrix, changes the neo-metabolic activity of cultured chondrocytes in 3D scaffolds, and subsequently accelerate the growth and remodeling of cartilage tissue. The aim of review is to discuss the promotion of proliferation and secretion of chondrocytes by mechanical factor, mechanisms by which chondrocytes respond to mechanical signals, and the applications of bioreactor in cartilage tissue engineering.

Key words: mechanical loading; chondrocyte; mechanical signal; bioreactor; cartilage tissue engineering

多種原因造成的關(guān)節(jié)軟骨病變比較常見，軟骨損傷后缺乏自愈能力，尋找軟骨缺損修復(fù)的方法一直是臨床的難題。近年來，隨著組織工程學(xué)技術(shù)的發(fā)展，開展體外構(gòu)建組織工程化軟骨的研究越來越被人們重視。適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激因素可以在一定程度上克服傳統(tǒng)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)條件的不足，滿足細(xì)胞在可吸收聚合物中的營養(yǎng)需要，減少處于中心部位的軟骨細(xì)胞由于營養(yǎng)不良或代謝不暢而導(dǎo)致的生長遲滯甚至死亡。因此，對軟骨細(xì)胞進(jìn)行三維立體培養(yǎng)時，研究力學(xué)刺激對細(xì)胞的影響、力學(xué)信號的傳導(dǎo)機(jī)制以及應(yīng)用生物反應(yīng)器對體外培養(yǎng)的細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增都將對軟骨組織工程的發(fā)展有著非常重要的意義。

1軟骨組織的生物力學(xué)性狀

軟骨由軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)構(gòu)成，軟骨細(xì)胞包埋于軟骨陷窩內(nèi)，軟骨基質(zhì)由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌。軟骨基質(zhì)主要由膠原和蛋白多糖組成。膠原纖維在軟骨的不同層面排列形成不同結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的拉伸性能；蛋白多糖凝膠分散在膠原纖維網(wǎng)之間，本身不具有抗壓作用，但由于蛋白多糖有很強(qiáng)的吸水膨脹性，加上蛋白多糖上經(jīng)常有固定負(fù)電荷互相排斥，使它有充分?jǐn)U展傾向，而這個傾向卻被周圍的膠原纖維網(wǎng)約束了，最終兩者達(dá)到壓力平衡[1]，使軟骨內(nèi)部在未受外力時就存在一個膨脹壓（滲透壓）。當(dāng)外力大于膨脹壓時，引起液體外流，蛋白多糖濃度增加，滲透壓增大以對抗外壓力，同時將壓力傳遞給膠原纖維，使壓應(yīng)力轉(zhuǎn)化為張應(yīng)力。因此，外界因素如異常應(yīng)力導(dǎo)致蛋白多糖、膠原的減少、破壞或微細(xì)結(jié)構(gòu)的改變等，都會引起關(guān)節(jié)軟骨力學(xué)性能的變化。

2力學(xué)刺激的應(yīng)用

2.1 壓力：壓力是正常人體關(guān)節(jié)軟骨最主要的受力，可以將其看成是由一系列隨時間變化的動態(tài)成分和隨時間緩慢發(fā)展的靜態(tài)成分組成[2]，因而體外研究實驗多采用的壓力方式有兩種：一種是持續(xù)靜壓力，另一種為動態(tài)壓力。

靜壓力多為早期研究所關(guān)注的加載方式，它的施加使組織保持持續(xù)恒定的壓縮狀態(tài)，但普遍發(fā)現(xiàn)基質(zhì)的合成將受到抑制。近年的研究對于靜壓力的作用效果有更深一步理解，Quinn 等[3]認(rèn)為靜壓力使培養(yǎng)基內(nèi)可溶物質(zhì)運(yùn)輸受限，而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞代謝水平下降，Ragan 等[4]發(fā)現(xiàn)40h持續(xù)靜壓力只是促使新合成的蛋白多糖分子流失到培養(yǎng)基中，并不伴隨蛋白多糖分子的大小、成分的改變，認(rèn)為靜壓力不引起細(xì)胞代謝途徑的變化。

研究發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)動態(tài)壓力作用下，軟骨組織內(nèi)四種物理特性發(fā)生變化：靜水壓、毛細(xì)液流及其引起的離子濃度與電荷變化、流能和組織與細(xì)胞變形。Huang 等[5]分組對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞施加周期性壓力(強(qiáng)度為壓縮10%、頻率為1 Hz，4 h/d)，處理3、7、14天后, 發(fā)現(xiàn)TGF-β1 干預(yù)組、壓應(yīng)力干預(yù)組、TGF-β1與壓應(yīng)力復(fù)合干預(yù)組的TGF-β1 及軟骨分化標(biāo)志物的表達(dá), 均較靜止對照組增強(qiáng)，提示壓應(yīng)力可能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨性分化，并推斷其通過增強(qiáng)TGF-β1基因表達(dá)來調(diào)節(jié)。一些生長因子也與力學(xué)刺激具有某種聯(lián)系，如生理范圍內(nèi)的正弦動態(tài)壓力刺激可使胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對關(guān)節(jié)軟骨蛋白及蛋白多糖合成的促進(jìn)作用的時間提前，提示力學(xué)作用不但可以單獨(dú)刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，還可促進(jìn)IGF這種可溶性細(xì)胞生長因子與相對分散的單個細(xì)胞的結(jié)合[6]。這也提示聯(lián)合應(yīng)用力學(xué)因素和生物活性因子優(yōu)于應(yīng)用單一方法，可以更有效地進(jìn)行體外軟骨組織構(gòu)建和體內(nèi)缺損的修復(fù)。

2.2 流體靜壓力：流體靜壓力，也有稱其為生理液態(tài)壓力，是生理活動時對軟骨細(xì)胞影響最大的力[7]。實驗表明選用的間歇性流體靜壓力負(fù)荷低于或近似于生理水平(1～10MPa)，將不會引起細(xì)胞形變[8]，并能提高軟骨細(xì)胞蛋白多糖和Ⅱ膠原的mRNA 的表達(dá)水平[9]，對基質(zhì)的合成、積累有重要作用；而超過生理范圍的持續(xù)高流體靜壓力則會改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、破壞高爾基體，導(dǎo)致正常的軟骨細(xì)胞向關(guān)節(jié)炎樣細(xì)胞變化[10]。

2.3 剪切力：流體剪切力是機(jī)體內(nèi)微環(huán)境重要組成部分。目前，流體剪切應(yīng)力模型有錐板流動室、平行平板流動室、板板流動室、圓柱管流動室和徑向流動室。李洪鵬等[11]利用平行平板流動室對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加載0.5Pa 的流體剪切力30min后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力提高，細(xì)胞活性增強(qiáng)，S期細(xì)胞百分比較對照組增高約180%。Malaviya等[12]將3.5Pa的流體剪切力作用到單層培養(yǎng)的牛原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上，96h后發(fā)現(xiàn)流體剪切力可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，施加剪切力組培養(yǎng)液中的TGF-β1是靜止組的3.5倍，培養(yǎng)液起到了有絲分裂原的作用；當(dāng)用抗TGF-β1抗體或抗TGF-β1II型受體抗體時，這種作用被阻斷，但由于阻斷作用是部分的，可以推測流體剪切力促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖是部分TGF-β1及其受體介導(dǎo)的。Waldman等[13]選用小幅度的剪切力（1%～3%應(yīng)變），先將軟骨細(xì)胞種植在生物陶瓷支架中，讓其自由生長4 周后，再施加間歇性剪切力作用4周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8 周后的樣本對比未加力組，無論從厚度、脫水重量、壓縮模量、平衡模量還是蛋白多糖、膠原量都顯著增加，這可能與剪切力作用改變了細(xì)胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

2.4 離心力：離心力的施加主要是利用復(fù)合物在離心機(jī)內(nèi)高速旋轉(zhuǎn)，從而對復(fù)合物產(chǎn)生離心力，該辦法不要求特殊設(shè)備，較為簡單。將高密度軟骨細(xì)胞接種在離心管內(nèi)，離心力可能發(fā)揮了類似生物體內(nèi)應(yīng)力的作用，可以使軟骨細(xì)胞按固定方向進(jìn)行空間排列，在支架材料中形成一定的初期分布，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的交換和細(xì)胞的增殖代謝?？浊迦萚14]將軟骨細(xì)胞種植在脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)材料上，并移入離心管中培養(yǎng)，每天取出離心管置于離心機(jī)上離心3次，每次離心時間20min，相對離心力約為200g，復(fù)合物培養(yǎng)至8 周后與靜態(tài)培養(yǎng)組比較發(fā)現(xiàn)，離心力的作用主要是能刺激軟骨細(xì)胞分泌GAG和Ⅱ型膠原增加，并使該類軟骨組織具一定層次排列結(jié)構(gòu)，而靜態(tài)培養(yǎng)的類軟骨組織排列較為紊亂。劉天一等[15]研究離心力和搖床力對三維支架軟骨誘導(dǎo)劑培養(yǎng)的豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)第4 周和8 周時，兩組實驗組的細(xì)胞材料復(fù)合物形狀保持良好，細(xì)胞生長情況、軟骨陷窩形成、蛋白多糖沉積及Ⅱ型膠原合成均明顯優(yōu)于對照靜止組，從而表明種子細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程化軟骨中, 施加力學(xué)刺激也可以促進(jìn)軟骨組織成熟。

2.5 張力：在生物體運(yùn)動過程中, 細(xì)胞組織常常受到動態(tài)的牽拉應(yīng)力作用, 體內(nèi)牽拉力是通過細(xì)胞外基質(zhì)傳遞到細(xì)胞的，因此張應(yīng)力學(xué)模型通常是以彈性膜為基底材料，利用模板、液體或氣體對基底膜施加可控的位移或壓力作用, 引起培養(yǎng)膜發(fā)生彈性變形, 從而使粘附于膜上的細(xì)胞受到相應(yīng)的張應(yīng)變作用。Wright等[16]對體外培養(yǎng)的人長骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞施以牽張力后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞cAMP及蛋白多糖的合成增加。低頻率、低強(qiáng)度的牽張力可促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成分泌蛋白多糖，而高頻率、高強(qiáng)度的牽張力則抑制蛋白多糖的合成和分泌[17]。所以適當(dāng)?shù)膹埩纱龠M(jìn)單層培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的增生和分泌，這與體內(nèi)研究的結(jié)果一致。

3力學(xué)載荷可能的信號傳導(dǎo)機(jī)制

力學(xué)刺激體外細(xì)胞所引起一系列的變化，是通過一定的途徑, 將細(xì)胞外力學(xué)信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，從而啟動或調(diào)節(jié)相關(guān)的基因蛋白表達(dá)分布。國內(nèi)外大量研究表明，機(jī)械載荷刺激細(xì)胞組織后，其基本的機(jī)械力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制與調(diào)節(jié)過程具有相同信號途徑，主要為3 條：通過細(xì)胞外基質(zhì)信號-跨膜整合素-細(xì)胞骨架構(gòu)像改變對信號的傳遞，激活細(xì)胞膜力敏感離子通道介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，觸動G蛋白偶聯(lián)酪氨酸激酶磷酸化與促分裂原活化蛋白激酶調(diào)節(jié)的級聯(lián)反應(yīng), 各信號分子之間存在網(wǎng)絡(luò)狀調(diào)控, 最后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子的激活。戚孟春等[18]用過高的牽拉應(yīng)力(4 000με,0.5Hz)系統(tǒng)干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，激光共聚焦顯微鏡觀察到細(xì)胞骨架F-actin解聚和重排, 并誘發(fā)部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，表明細(xì)胞骨架是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳導(dǎo)力學(xué)信號通路中重要的一環(huán)。整合素對于許多類型的細(xì)胞粘著于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白具有重要作用，是介導(dǎo)力學(xué)的重要物質(zhì)，因為它們能夠與肌動蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)相互作用，通過細(xì)胞骨架來與細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生聯(lián)系。Holmvall等[19]在軟骨細(xì)胞中及軟骨肉瘤細(xì)胞中均可分離到α1β1和α2β1整合素，能夠表現(xiàn)與軟骨特異性基質(zhì)成分II型膠原的高親和性；在力學(xué)刺激下，基質(zhì)成分II型膠原及整合素mRNA均明顯升高，而β1整合素亞單位并未改變，α5或α2整合素有所升高，α2β1整合素與II型膠原結(jié)合位點很可能介導(dǎo)了力學(xué)刺激。

4生物反應(yīng)器的應(yīng)用

目前體外軟骨構(gòu)建技術(shù)主要存在組織“空心”、力學(xué)強(qiáng)度差以及難以精確塑形等問題。生物反應(yīng)器的出現(xiàn)及其在軟骨組織工程中的應(yīng)用為解決這些問題帶來了希望[20]，主要是因為它能模擬體內(nèi)微環(huán)境，為細(xì)胞生長傳輸物質(zhì)，并可施加各種力學(xué)刺激，彌補(bǔ)體外培養(yǎng)條件的不足。因此，生物反應(yīng)器已逐漸成為軟骨組織工程的一個重要研究領(lǐng)域。

4.1 機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器：該生物反應(yīng)器的支架-細(xì)胞復(fù)合物懸在反應(yīng)器的瓶塞上，支架周圍加入培養(yǎng)液，位于培養(yǎng)瓶底部的磁棒不斷攪拌，每隔數(shù)日更換培養(yǎng)液以保持營養(yǎng)。這種生物反應(yīng)器的剪力梯度與營養(yǎng)酸堿度變化曲線及不均勻的物體交換率可影響細(xì)胞生長。然而，這樣的培養(yǎng)體系能使CO2和O2的濃度達(dá)到一個類似正常的平衡狀態(tài)，避免靜態(tài)培養(yǎng)中O2的降低和CO2的聚集[21]。

4.2 灌注式生物反應(yīng)器：該生物反應(yīng)器用繼發(fā)性液流替代機(jī)械性攪拌，通過蠕動移液泵使培養(yǎng)液循環(huán)流動。其中的細(xì)胞處于一個動態(tài)層流場且時刻保持恒定營養(yǎng)供應(yīng)的環(huán)境，同時還避免了常規(guī)一次性全部換液帶來的培養(yǎng)環(huán)境的驟變[22]。與振蕩式生物反應(yīng)器相比，它所培養(yǎng)的細(xì)胞密度可提高20倍。目前，這一裝置多用于三維材料-細(xì)胞復(fù)合體的培養(yǎng)。

4.3 間歇性生理液壓生物反應(yīng)器：該生物反應(yīng)器是先將軟骨細(xì)胞或軟骨塊置于培養(yǎng)皿中，其中加滿完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿上蓋雙層壓力膜，排出培養(yǎng)皿內(nèi)空氣，使壓力膜與培養(yǎng)皿貼緊至不留氣泡。將該培養(yǎng)皿置于圓柱形壓力室中，壓力和頻率由計算機(jī)控制下的壓力閥來調(diào)控。Carver等[23]發(fā)現(xiàn)間歇性生理液態(tài)壓力可明顯促進(jìn)聚羥基乙酸網(wǎng)上培養(yǎng)的馬軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，其蛋白多糖的含量至少是無壓力培養(yǎng)下的兩倍。

4.4 旋轉(zhuǎn)式微重力生物反應(yīng)器：該生物反應(yīng)器由兩個同軸的容器構(gòu)成，內(nèi)瓶靜止，允許氣體通過瓶壁與外瓶交換；外瓶瓶壁封閉，兩瓶中間為培養(yǎng)液。通過調(diào)節(jié)外瓶轉(zhuǎn)速，使離心力和重力平衡，達(dá)到模擬體內(nèi)細(xì)胞所處的微重力狀態(tài)。該系統(tǒng)使細(xì)胞在支架材料內(nèi)分布較均勻、分化狀態(tài)較好且細(xì)胞密度較大[24]。在軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增的初期，由于軟骨細(xì)胞和支架材料尚未復(fù)合緊密，力學(xué)作用會使復(fù)合不牢的軟骨細(xì)胞脫落而無法達(dá)到軟骨細(xì)胞-支架材料共同培養(yǎng)，體外擴(kuò)增的目的。而該裝置破壞性應(yīng)力相對較小或無明顯破壞性應(yīng)力，可以克服上述問題，并產(chǎn)生大的軟骨，且組織結(jié)構(gòu)及成分都接近正常軟骨，可以用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的缺損。

5小結(jié)

模擬正常體內(nèi)的力學(xué)環(huán)境對于體外構(gòu)建組織工程化軟骨起到非常重要的作用。利用動態(tài)壓力、流體靜壓力、剪切力、離心力、張力都能提供不錯的力學(xué)刺激，尤其是生物反應(yīng)器的設(shè)計與應(yīng)用更加優(yōu)化了培養(yǎng)環(huán)境，提高了工程化軟骨的質(zhì)量。雖然力學(xué)因素的作用機(jī)制還不十分明確，構(gòu)建的組織工程化軟骨的生物力學(xué)性能仍低于正常體內(nèi)軟骨的力學(xué)性質(zhì), 但隨著研究的深入和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 用組織工程技術(shù)來修復(fù)軟骨缺損及病變的時代已不再遙遠(yuǎn)。

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[收稿日期]2008-12-27[修回日期]2009-02-11

編輯/張惠娟