紫外線誘導的面部毛細血管擴張動物模型的建立

張麗宏　李春雨　張桂芬

[摘要]目的：為篩選治療面部毛細血管擴張藥物建立動物模型。方法：采用260～350nmUVB和340～400nmUVA長期照射大鼠背部裸露皮膚，通過HE染色觀察大鼠皮膚組織學變化。結果：與空白組大鼠皮膚相比較，各組大鼠皮膚均出現(xiàn)不同程度的毛細血管擴張，造模成功。結論：本實驗所研究的造模方法簡便易行，經(jīng)濟可靠，可復制性強。

[關鍵詞]面部毛細血管擴張；紫外線；動物模型

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2009）02-0336-03

The establishment of facial telangiectasia animal modle by ultraviolet irradition

ZHANG Li-hong,LI Chun-yu,ZHANG Gui-fen

(Jiamusi Medical College，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China)

Abstract: Objective To establish animal model for evaluation of drugs facial telangiectasia. Methods The dorsal hairless rats were exposed to ultraviolet A(UVA340～400nm) and ultraviolet B(UVB260～350nm) for a long-term.To observe the degree of skin damage by HE strain. Results The telangiectasia of each group was differently obvious that they compared to control group. The animal model of facial telangiectasia was copied successfully. Conclusions The study on construction of animal modle was investigated. The method is easy, economic and repeatable. It can be generally used for facial telangiectasia study.

Key words: facial telangiectasia; ultraviolet; animal modle

伴隨著生活水平的提高，人們對“形神俱美”的渴望愈加強烈，特別是在由生物醫(yī)學模式轉向生物-心理-社會醫(yī)學模式的今天，美麗的容顏成為人們追求的目標。面部毛細血管擴張癥是影響美容的主要因素之一，不但影響人們的外表，而且嚴重影響皮膚汲取營養(yǎng)，久而久之導致皮膚供養(yǎng)不足，造成粗糙，干燥和過早衰老的癥狀。既往治療面部毛細血管擴張的方法很多，如局部外用雌激素、液態(tài)氮冷凍、二氧化碳激光、微波、電灼等[1-2]，但都存在操作繁瑣，副作用大，易復發(fā)等缺點。尋找有效藥物對抗毛細血管擴張，已經(jīng)成為研究熱點。面部毛細血管擴張動物模型是研究面部毛細血管擴張機理及篩選防治面部毛細血管擴張藥物的重要媒介。目前，面部毛細血管擴張動物模型國內(nèi)外均未見報道。本文通過紫外線誘發(fā)大鼠皮膚毛細血管擴張模型，為新藥的研發(fā)奠定基礎。

1材料

1.1儀器：SS-03AB型紫外線光療儀（UVB發(fā)射光譜260～350nm，峰值311nm；UVA發(fā)射光譜340～400nm，峰值365nm），上海希格瑪高技術有限公司；UVB、UVA紫外線輻照計，北京師范大學光電儀器廠；大鼠固定器（200g），蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司；勁霸牌JB718型電推剪。

1.2動物：健康雌性Wistar大鼠50只，4～6月齡，體重(0.2±0.02)kg，佳木斯大學動物中心提供。

2方法

2.1 動物分組：將50只大鼠隨機分為3組，分別為空白組（10只），模型組（30只），模型監(jiān)測組（10只）。將大鼠置于大鼠固定器中，用記號筆標記大鼠背部兩側擬照射的范圍，每側4cm2，取出大鼠，用電推剪剃凈該范圍內(nèi)的毛，隔天剃一次，使皮膚充分暴露。

2.2 動物照射：空白組大鼠僅剃除背部標記部位的毛，不予紫外線照射；模型組大鼠和模型監(jiān)測組大鼠剃毛后置于固定器中，于紫外線光療儀下100cm處（用紫外線輻照計測得UVB強度為0.12mW/cm2 UVA強度為1.05mW/cm2）照射，每天照射15min；模型組30只大鼠隨機分為3組，分別照射20天、30天、40天；模型監(jiān)測組大鼠于實驗30天末停止照射，自然恢復10天。觀察照射期間及停止照射后局部皮膚變化。

2.3 取材：分別于實驗第20天、30天和40天末，將各組大鼠用乙醚麻醉，置于自制手術臺上，剃毛，常規(guī)手術切取背部皮損組織約1cm2，用4%中性福爾馬林溶液固定。

2.4 HE染色

2.4.1 HE染液的配制：①Harris蘇木素：蘇木素1g溶于10ml無水酒精中，硫酸鋁鉀20g溶于200ml蒸餾水中。兩液分別加溫溶解后混合，繼續(xù)加熱煮沸，離火后加入0.5g黃色氧化汞，用玻璃棒攪拌至溶液呈深紫色，立即將容器置冷水中迅速冷卻后過濾，加入4ml冰醋酸即配成Harris蘇木素；②伊紅溶液：將lg伊紅溶于100ml蒸餾水中，待溶解后加入30ml冰醋酸。邊加邊攪拌，使之呈混懸液，再加入蒸餾水100ml，使其作用10～20min，過濾，取沉淀物烤干，然后取0.25～0.50g溶于95%酒精100ml中即配成伊紅溶液。

2.4.2石蠟切片：切取的標本經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等過程制成蠟塊，然后切片，將切下的蠟片置于溫水中，選擇完整、無劃痕、厚薄均勻的蠟片，附貼到載玻片上，每張切片標記相應編號。

2.4.3 HE染色過程：①二甲苯脫蠟：2次，每次10min；②梯度酒精脫二甲苯：100%、90%及80%酒精各3min；③自來水沖洗，甩干；④蘇木素染色5min，自來水沖洗，甩干；⑤鹽酸酒精分化9s，自來水沖洗，甩干；⑥氨水返藍9s，自來水沖洗，甩干；⑦伊紅染色3min，自來水沖洗，甩干；⑧梯度酒精脫水：80%、90%及100%酒精各3min；⑨二甲苯透明：2次，每次3min；⑩中性樹膠封片；⑾顯微鏡下觀察結果（×200）。

3結果

3.1肉眼觀察

模型組大鼠受照皮膚早期可見輕度紅斑，隨著時間的推移逐漸出現(xiàn)表皮顏色加深、皮膚增厚、粗糙變硬、失去彈性及光澤的現(xiàn)象。與空白組比較模型組大鼠皮膚受照部位異常改變明顯。模型監(jiān)測組大鼠停照10天后，皮膚紅斑有所減輕。

3.2皮膚組織學變化：空白組大鼠皮膚（圖1）表皮層結構完整，細胞層清晰可見，厚度正常，真皮層可見波浪狀纖維組織排列有序，分布均勻，毛細血管正常；紫外線照射20天組大鼠皮膚（圖2）真皮血管輕度擴張；紫外線照射30天組大鼠皮膚（圖3）真皮血管明顯擴張，少量淋巴細胞浸潤；紫外線照射40天組大鼠皮膚（圖4）真皮血管擴張，血管數(shù)量減少，大量淋巴細胞浸潤，膠原纖維斷裂；模型監(jiān)測組大鼠皮膚（圖5）停止照射紫外線10天后，觀察到表皮黑色素沉積及真皮層毛細血管擴張均有所減輕，但同正常皮膚相比差別較大。

4討論

日光中的UV分別為短波（UVC100～290nm）、中波（UVB290～320nm）和長波（UVA320～400nm）。由于大氣層中存在臭氧層，UVC幾乎被全部吸收，到達地面的紫外線主要為UVA和UVB。由于UVA的生物活性比UVB弱的多，大約是UVB的1/1000，所以人們過去認為引起皮膚產(chǎn)生紅斑的UV主要是UVB，而UVA除了能使皮膚曬黑外，幾乎對人體無害[3]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)UVA（320～400nm）劇烈照射與UVB一樣，也能產(chǎn)生擴張和血管損傷，甚至引起的改變比UVB更為嚴重[4]，只是產(chǎn)生這種效應所需的劑量較UVB大1000倍，日光中UVA是UVB劑量的500～1000倍，可見UVB和UVA 都是造成毛細血管擴張的主要因素。本實驗中采取UVA、UVB聯(lián)合的方法照射大鼠背部剃毛區(qū)，觀察到隨著照射天數(shù)的增加，大鼠皮膚出現(xiàn)從輕度紅斑到明顯紅斑，再到皮膚顏色加深、粗糙變硬的變化，光鏡下可觀察到真皮下毛細血管擴張，提示造模成功。

造模過程中照射劑量是決定造模成功與否以及實驗周期長短的關鍵因素。在預實驗中曾采用每天照射5min的方法制造毛細血管擴張模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過50天的照射大鼠皮膚沒有明顯改變，60天后才出現(xiàn)輕度紅斑，這樣就延長了實驗周期。之后采用每天照射20min的方法，發(fā)現(xiàn)僅經(jīng)過幾次照射，大鼠皮膚出現(xiàn)水泡、糜爛，提示大鼠皮膚被灼傷。經(jīng)過摸索最后確定每天15min的照射劑量，大鼠的皮膚不但不會被灼傷，而且實驗20天就可觀察到毛細血管輕度擴張，30天時毛細血管明顯擴張，縮短了實驗周期。

在預實驗過程中發(fā)現(xiàn)，當大鼠裸露皮膚經(jīng)過30天紫外線照射時，毛細血管明顯擴張且黑色素少量沉積，是比較理想的毛細血管擴張模型。為檢測所造模型的持久性，在正式實驗中設置模型監(jiān)測組，即大鼠經(jīng)過30天的照射后自然恢復10天，通過所得皮膚組織學變化照片觀察到毛細血管的擴張程度減輕，但與空白組相比較區(qū)別仍然顯著，提示本實驗所采用的造模方法簡便易行，經(jīng)濟可靠，可復制性強。

本研究建立毛細血管擴張動物模型的同時，也得出了皮膚隨照射時間延長而發(fā)生的表象及皮膚組織的變化規(guī)律，毛細血管在紫外線照射早期扭曲、增粗擴張，隨即管壁變薄、數(shù)量明顯減少，真皮中的血管損傷，其程度與照射時間成正比，其數(shù)量與照射時間成反比。

綜上所述，用紫外線照射法建立面部毛細血管擴張動物模型，其方法可靠、簡便，有望成為篩選治療面部毛細血管擴張藥物的造模手段，為美容產(chǎn)品的研發(fā)提供方便。

[參考文獻]

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[2]Kay A Coleman,著。姚培元,李德淳,譯.醫(yī)學美容換膚術[M].天津:天津科技翻譯出版社，2000:243-479..

[3]Kligman AM. Early destructive effects of sunlight on humanskin［J］. JaMa, 1969, 272:2377-2380.

[4]Krutmann J.Ultraviolet A radition induced biological effects in humman skin:relevance for photoaging and photodermatosis［J］.J Dermatol Sci,2000,23(suppl1):22-26.

[收稿日期]2008-11-06[修回日期]2009-01-07

編輯/張惠娟