玻璃化凍存骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

尹宏宇　孫　劍　劉廣鵬　崔　磊　曹誼林

[摘要]目的：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是構(gòu)建組織工程化骨主要的種子細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)BMSCs的深低溫保存對(duì)骨組織工程具有重要意義。目前，玻璃化凍存是最有發(fā)展前景的凍存方法，因此希望通過(guò)改進(jìn)玻璃化液和預(yù)處理?xiàng)l件來(lái)提高BMSCs的玻璃化凍存效果。方法：采用不同組成及濃度的玻璃化液在不同的預(yù)處理?xiàng)l件下對(duì)第2（P2）代成骨誘導(dǎo)的犬骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（cBMSCs）進(jìn)行玻璃化凍存實(shí)驗(yàn)，通過(guò)復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率來(lái)選擇一種理想的玻璃化液及適合的預(yù)處理?xiàng)l件，并在此基礎(chǔ)上再與常規(guī)凍存的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，同時(shí)考慮凍存過(guò)程對(duì)細(xì)胞成骨活性的影響。結(jié)果：將VS226作為玻璃化液，在0℃/5min的預(yù)處理?xiàng)l件下玻璃化凍存P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs，與常規(guī)凍存后的細(xì)胞存活率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且凍存過(guò)程對(duì)此細(xì)胞的成骨能力沒(méi)有影響。結(jié)論：采用VS226來(lái)玻璃化凍存BMSCs，可實(shí)現(xiàn)為骨組織工程提供大量種子細(xì)胞的目的。

[關(guān)鍵詞]深低溫保存；玻璃化凍存；骨組織工程；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）03-0318-05

Experimental study of vitrification preservation for BMSCs

YIN Hong-yu1, SUN Jian3, LIU Guang-peng3,CUI Lei2,3,CAO Yi-lin1,2,3

(1. Research Center Of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College, Beijing 100041, China; 2.Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011, China; 3.Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center, Shanghai 200234, China.)

Abstract: Objective Bone marrow stromal cells (BMSCs) have become the main cell source for tissue-engineered bone. There is of great significance for bone tissue engineering to cryopreserved BMSCs. At present, vitrification preservation is the most promising methods of cryopreservation for cells. The effect of vitrification method for BMSCs was wished to enhance by improving the vitrified solution and the pretreatment condition. Methods Using the different composition and concentration of vitrification fluid, the freezing experiments on osteogenically induced canine bone marrow stromal cells (cBMSCs) at passage 2 (P2) were performed under the different preconditioning. According to the cellular survival rate after rewarming, the ideal vitrification media and optimal pretreatments were chosen to cryopreserve the cells in order to compare with the experimental result of slow-freezing. Simultaneously, the influence of vitrification protocol on osteogenic activity of the cells needed to be considered. Results Taking the VS226 as a vitreous cryoprotectant, osteo-induced cBMSCs at P2 were banked under 0℃/5min of the pretreatment condition. There was no statistical significance of percent cell viability post-thaw between routine and vitrification method, and the cooling process did not affect osteogenic ability of the cells. Conclusions Based on these results, it can be concluded that BMSCs frozen by vitrification with VS226 can be used to provide the massive seed cell for bone tissue engineering.

Key words: cryopreservation; vitrification; bone tissue engineering; bone marrow stromal cells

組織工程學(xué)是一門(mén)以細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)相結(jié)合, 進(jìn)行體外和體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興學(xué)科[1]。構(gòu)建的方法主要是在支架材料上接種高濃度的種子細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)。骨組織工程是組織工程的主要分支，其種子細(xì)胞以成骨誘導(dǎo)的BMSCs為主，因此組織工程化骨的構(gòu)建迫切需要進(jìn)行大量種子細(xì)胞的冷凍貯備。玻璃化凍存技術(shù)是近年來(lái)低溫生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最快的研究方向之一。本文通過(guò)采用一種新研制的玻璃化液對(duì)成骨誘導(dǎo)的cBMSCs進(jìn)行玻璃化凍存的研究，以期能使組織工程化骨的種子細(xì)胞獲得理想的玻璃化凍存效果。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 動(dòng)物：2歲齡Beagle犬3條，雌雄不限，體重約20kg，上海農(nóng)學(xué)院提供。

1.1.2 試劑：Percoll原液：77237 Percoll （sigma公司，美國(guó)）；BM Purple染色劑（Boehringer Mannheim公司，德國(guó)）；茜素紅染液（sigma公司，美國(guó)）。

1.2方法

1.2.1 cBMSCs的分離和體外誘導(dǎo)培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)犬以5 %的戊巴比妥鈉（0.5ml/Kg）麻醉后，抽取骨髓2.5ml。根據(jù)以前報(bào)道的方法[2]進(jìn)行Percoll液的配制和犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離提純。將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后開(kāi)始應(yīng)用含有地塞米松（10mmol/L）、β-磷酸甘油鈉（2.16g/L）和2-磷酸抗壞血酸（37.5mg/L）的成骨條件培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至第8天，細(xì)胞克隆形成單位的中心生長(zhǎng)達(dá)密集時(shí)用0.25 %胰蛋白酶-0.02%EDTA進(jìn)行第1次傳代[3]。以1.6×104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代。

1.2.2 凍存液的制備：常規(guī)凍存液由體積比為10%二甲基亞砜（DMSO）、50%胎牛血清（FBS）和40%細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM）組成；根據(jù)文獻(xiàn)[4]制備玻璃化液VS55；其它玻璃化液參見(jiàn)表1（根據(jù)文獻(xiàn)[4]制備EC液）。

1.2.3細(xì)胞的深低溫保存方法：①常規(guī)凍存：將P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs消化離心后倒除上清液，用0.5ml常規(guī)凍存液重懸并置入2ml凍存管中，先在4℃預(yù)冷30min，再置于-20℃ 2h，經(jīng)過(guò)24h的-80℃保存后投入液氮（-196℃）；②玻璃化凍存：將同樣方法獲得的細(xì)胞用同體積的玻璃化液重懸于凍存管中，經(jīng)過(guò)不同的預(yù)處理方案，包括將凍存管放入冰水混合物(0℃)中或置于室溫（25℃）下分別保持5min或15min后再直接投入液氮，或立即投入液氮（0min）。

1.2.4 深低溫保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法：從液氮中取出冷凍保存1天的凍存管，在37℃ 水浴中快速搖晃進(jìn)行復(fù)溫，將復(fù)溫后的細(xì)胞溶液迅速轉(zhuǎn)移到離心管中并加入成骨條件培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，離心（1 500 轉(zhuǎn)/min，5 min）后去上清液，共洗滌2次。

1.2.5 深低溫保存細(xì)胞復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率[5]：將3×105個(gè)P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式：增殖率=細(xì)胞總數(shù)÷(3×105)，來(lái)獲得未凍存細(xì)胞的增殖率。然后深低溫保存3×105個(gè)此細(xì)胞，凍存1天后復(fù)蘇，繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)6天，同樣獲取培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，利用公式：細(xì)胞存活率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)÷(3×105×增殖率)，以得出凍存細(xì)胞的存活率。

1.2.6 生化檢測(cè)：根據(jù)以前報(bào)道的方法[2]分別將P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs進(jìn)行凍存前后的堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色。。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件處理，行t檢驗(yàn)。每個(gè)檢測(cè)樣本重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 不同玻璃化液在不同的預(yù)處理?xiàng)l件下進(jìn)行玻璃化凍存對(duì)細(xì)胞存活率的影響：如圖1所示，用不同的玻璃化液對(duì)P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs進(jìn)行玻璃化凍存，不論預(yù)處理時(shí)間是0min、5min，還是15min，預(yù)處理溫度為0℃時(shí)的細(xì)胞存活率明顯高于25℃（P<0.05）。在同樣的預(yù)處理溫度下，VS28、VS226和VS55的細(xì)胞存活率5min和15min明顯優(yōu)于0min（P<0.05），且5min和15min之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；VS37和VS334的細(xì)胞存活率5min>15min>0min（P<0.05）；VS46和VS442則5min明顯優(yōu)于15min 和0min（P<0.05）。由此可見(jiàn)，在0℃條件下用玻璃化液對(duì)此細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理5min的玻璃化凍存效果最好。對(duì)于不同組分和配比的玻璃化液，不論是室溫還是冰水混合物的情況下，只要有預(yù)處理時(shí)間（5min或15min），含有EC液成分的玻璃化液的細(xì)胞存活率均好于不含EC液的結(jié)果（P<0.05），而在0min的無(wú)預(yù)處理時(shí)差別不明顯，因此EC液成分是有助于細(xì)胞的玻璃化凍存。對(duì)DMSO而言，只要細(xì)胞在玻璃化凍存前進(jìn)行過(guò)預(yù)處理（5min或15min），隨著DMSO濃度的增加凍存后的細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05），說(shuō)明較高濃度的DMSO不利于細(xì)胞的玻璃化凍存。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，25℃時(shí)高濃度DMSO的細(xì)胞存活率下降程度高于0℃時(shí)的情況（P<0.05），說(shuō)明在低溫環(huán)境下可減輕高濃度DMSO對(duì)細(xì)胞的損傷。在檢測(cè)的各種玻璃化液中，用VS226玻璃化凍存細(xì)胞的存活率最高，在0℃/5min的預(yù)處理?xiàng)l件下可達(dá)73.0%±3.1%，由此被選作下一步實(shí)驗(yàn)的玻璃化液。

2.2 玻璃化凍存與常規(guī)凍存對(duì)細(xì)胞存活率的影響：同樣對(duì)P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs進(jìn)行深低溫保存，玻璃化凍存用VS226作為凍存液，預(yù)處理?xiàng)l件選擇在冰水混合物中預(yù)冷5min，從圖2可見(jiàn)，玻璃化凍存后的細(xì)胞存活率為75.0%±3.5%，而常規(guī)凍存是77.0%±2.4%，二者并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由此可見(jiàn)玻璃化凍存細(xì)胞達(dá)到了與常規(guī)凍存同樣的效果。

2.3 凍存對(duì)細(xì)胞成骨活性的影響：不論是玻璃化凍存還是常規(guī)凍存，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的P2代cBMSCs的ALP染色和茜素紅染色在凍存前后均為陽(yáng)性。ALP染色的細(xì)胞胞漿呈藍(lán)、綠色（圖3A）。茜素紅染色的細(xì)胞外基質(zhì)中可出現(xiàn)散在的結(jié)節(jié)狀紅染，在鈣化沉積區(qū)為深紅色，中心呈黑色（圖3B）。

3討論

凍存主要用于對(duì)細(xì)胞和組織的保存，隨著組織工程的發(fā)展使凍存的作用顯得尤為重要[6]。常規(guī)凍存[7]是通過(guò)添加冷凍保護(hù)劑、采用一定降溫程序緩慢降溫的一種方法。由于這種慢速冷凍方法比較成熟, 在許多研究領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的使用。玻璃化凍存是用高濃度且低毒的多種冷凍保護(hù)劑的協(xié)同效應(yīng)使細(xì)胞脫水到合適程度，然后通過(guò)快速降溫（常常會(huì)超過(guò)1 500℃/min），使含高含量防凍劑的液體粘滯度升高，液體分子的彌散運(yùn)動(dòng)被抑制，液體固化為一種類似于玻璃的非晶體狀態(tài)[8]。該方法是深低溫保存的新技術(shù)，不僅操作方法簡(jiǎn)便、快速, 不需昂貴的降溫設(shè)備，而且在快速降溫和復(fù)溫過(guò)程中迅速通過(guò)-5℃～-15℃的冷凍危險(xiǎn)區(qū)，從而防止了冰晶的產(chǎn)生，或雖有冰晶形成但沒(méi)有長(zhǎng)大到足以使細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的程度，進(jìn)而避免或減輕了細(xì)胞內(nèi)外冰晶和溶質(zhì)效應(yīng)對(duì)胞膜和細(xì)胞骨架等的損傷。因此與常規(guī)凍存相比，玻璃化凍存可以達(dá)到更好的深低溫保存效果。1985年，Rall 等[9]首先使用玻璃化法成功地進(jìn)行了小鼠胚胎的冷凍保存。現(xiàn)在，此冷凍方法已成功地凍存了人類胚胎[10]、卵子[11]和人類干細(xì)胞[12]等生物材料。

玻璃化冷凍在避免冰晶形成的同時(shí)，有潛在增強(qiáng)化學(xué)毒性的趨勢(shì)。這主要是由于高含量冷凍保護(hù)劑具有毒性作用。因此低毒性的，高滲透性的冷凍保護(hù)劑組合是其關(guān)鍵。冷凍保護(hù)劑可分成兩大類，即滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑。大量的資料[13-15]表明聯(lián)合運(yùn)用這兩種作用機(jī)制不同的凍存保護(hù)劑進(jìn)行玻璃化凍存，可以加強(qiáng)冷凍效果和減輕毒性。

DMSO是最常見(jiàn)的滲透性冷凍保護(hù)劑，它的高度水溶性使其易于透過(guò)細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)外形成高滲透壓，補(bǔ)償了胞內(nèi)、胞外存在的鹽梯度，因此可防止細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成和細(xì)胞膜的破壞[16]。EC液是器官保存灌洗液的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。作為模擬細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)成分和濃度的EC液可具有磷酸鹽緩沖作用，并擁有著可保持高滲透壓的葡萄糖（一種非滲透性冷凍保護(hù)劑）[18]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了加入EC液成分的玻璃化液具有很好的細(xì)胞凍存效果。眾所周知，細(xì)胞培養(yǎng)液包含著細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而其中的血清成分已被研究證明有利于細(xì)胞凍存[19]。本實(shí)驗(yàn)所用的玻璃化液就是由此配制而成，結(jié)果顯示用VS226進(jìn)行細(xì)胞的玻璃化凍存明顯優(yōu)于其他的玻璃化液。這是因?yàn)?0%和40%的DMSO濃度較高，對(duì)細(xì)胞傷害較大，而20%的濃度則是細(xì)胞保護(hù)和細(xì)胞毒性之間一個(gè)最佳點(diǎn)。同時(shí)此三種成分的合理配比使玻璃化凍存后的細(xì)胞存活率超過(guò)了VS55，并達(dá)到了常規(guī)凍存的效果。由此可見(jiàn)，VS226是一種理想的玻璃化凍存液。

為將玻璃化凍存中的細(xì)胞毒性損傷減小到最低限度,當(dāng)然還需要嚴(yán)格控制細(xì)胞與冷凍保護(hù)劑溶液接觸的溫度和時(shí)間，加快降溫和復(fù)溫的速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出預(yù)處理溫度為0℃的玻璃化凍存效果好于25℃，這是因?yàn)榈蜏丨h(huán)境可減少DMSO的細(xì)胞毒性[20]。而預(yù)處理時(shí)間以5min為最佳，這是由于將細(xì)胞與冷凍保護(hù)劑預(yù)先接觸可降低凍存過(guò)程中的滲透壓突變對(duì)細(xì)胞的打擊，而過(guò)長(zhǎng)的接觸時(shí)間又會(huì)增加凍存液對(duì)細(xì)胞的毒性損傷。

自從Vajta[21]發(fā)明了開(kāi)放型拉細(xì)凍存麥管(open pulled straw, OPS)，冷凍速率增至20000℃/min，大大加快了降溫復(fù)溫速率和提高了細(xì)胞存活率。但因吸入管內(nèi)液體僅為2μl，極大的限制了凍存細(xì)胞的數(shù)量，然而組織工程所需的細(xì)胞數(shù)量又較大，可見(jiàn)OPS法是很難滿足的。但常規(guī)的2ml凍存管卻可實(shí)現(xiàn)此要求，因此實(shí)驗(yàn)選用凍存管成裝細(xì)胞懸液。同時(shí)為增加熱交換率，實(shí)驗(yàn)僅用0.5ml的凍存液來(lái)混合細(xì)胞，以希望獲得更大的降溫和復(fù)溫的速率。但畢竟此方法無(wú)法達(dá)到OPS法的冷凍速率，這也說(shuō)明了本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞存活率不是非常高的原因。

由于在液氮（-196℃）溫度下，細(xì)胞、組織內(nèi)各種酶的活力及代謝很低，幾乎為零，生命處于所謂的“停滯”狀態(tài)。在此溫度下凍存的細(xì)胞，理論上可無(wú)限期保存[22]。鑒于深低溫保存的時(shí)間并不是問(wèn)題，因此本實(shí)驗(yàn)選用1天作為凍存的時(shí)間。

Kadiyala等[3]研究指出cBMSCs從P2代以后的細(xì)胞活性即開(kāi)始降低，這也就是為什么選用P2的cBMSCs進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的原因。目前，成骨誘導(dǎo)的BMSCs是骨組織工程重要的種子細(xì)胞，凍存細(xì)胞不但要保證高的細(xì)胞存活率，而且還要保持細(xì)胞的成骨活性。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)生化檢測(cè)驗(yàn)證了凍存過(guò)程并未影響成骨誘導(dǎo)cBMSCs的成骨能力。因此玻璃化凍存完全可以滿足骨組織工程中對(duì)細(xì)胞冷凍保存的要求。

總之，用VS226作為玻璃化液，經(jīng)0℃/5min的預(yù)處理后對(duì)P2代成骨誘導(dǎo)的cBMSCs進(jìn)行玻璃化凍存，復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率達(dá)到了與常規(guī)凍存相同的效果。

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[收稿日期]2008-11-12[修回日期]2009-02-08

編輯/張惠娟