常用病毒載體的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用

潘志敏，馬 勇，程細高

(南昌大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

基因治療是指能將外源基因?qū)氚屑毎⒂行П磉_從而實現(xiàn)治療疾病的一種療法。如何選擇高效、低毒、靶向性強的載體，以協(xié)助目的基因進入靶細胞并正確表達，是基因治療過程中必須解決的問題［1-2］，也是基因治療研究領(lǐng)域的核心技術(shù)之一?；蜉d體主要分為病毒載體和非病毒載體兩類［3］。病毒載體具備傳送其攜帶的基因組進入其他細胞并進行感染的分子機制［4］，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus，Rv)、腺病毒(Adenovirus)、慢病毒(Lentivirus，Lv)、腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus，AAV)及桿狀病毒(Baculovirus)等。

1 Rv載體

1.1 Rv及其載體的結(jié)構(gòu)

Rv在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下能將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA的單鏈RNA。其產(chǎn)物cDNA可進入細胞核并整合在染色體中隨宿主細胞的增殖而轉(zhuǎn)錄翻譯。Rv的RNA基因組核心部分含三個開放讀碼區(qū):gag-編碼病毒核心蛋白，PoL-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，env-編碼病毒被膜蛋白［5］。利用這些結(jié)構(gòu)可將Rv設(shè)計成一種復(fù)制缺陷性病毒，使其能攜帶某些目的基因。

1.2 Rv載體的優(yōu)缺點及改良

Rv載體的優(yōu)點有:(1)宿主范圍廣，對細胞感染率可高達100%;(2)能持久表達目的基因;(3)有強啟動子，能高效穩(wěn)定表達外源基因;(4)感染細胞不產(chǎn)生病變。Rv載體也有不足:(1)只能整合至分裂期細胞;(2)插入誘變，引起機體免疫反應(yīng);(3)雙嗜性Rv載體也不能解決感染特異性靶細胞問題。針對這些問題，研究者們不斷尋找解決方案:Roux等曾提出用雙特異性分子橋來解決感染特異性靶細胞問題。此分子橋既可與病毒顆粒結(jié)合，也可與特異細胞表面受體結(jié)合，從而引導(dǎo)病毒趨向特異性靶細胞。為提高Rv載體的轉(zhuǎn)染率，也有人提出多次重復(fù)感染，用水泡性口炎病毒包膜G蛋白替代原病毒蛋白包裝Rv。

1.3 Rv載體的應(yīng)用

以Rv為載體的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在基因治療、外源基因表達和RNA干擾等方面均有廣泛應(yīng)用。世界上第一例基因治療病例就是應(yīng)用Rv攜正常的腺苷脫氨酶(ADA)基因成功治愈了ADA缺乏癥患者。隨后英國奧蒙德大街醫(yī)院也運用Rv作為治療載體根治了一名患X染色體連鎖重癥免疫缺陷病兒童。

王韞芳等［6］利用復(fù)制缺陷型Rv和pMSCVneo成功構(gòu)建了pMSCV-HGF。為進一步應(yīng)用HGF基因進行干細胞工程、組織工程的研究奠定了基礎(chǔ)。還有顧紅祥等［7］將凋亡素基因(VP3)與Rv連接，構(gòu)建出重組Rv凋亡素載體，用其感染人肝癌細胞系HepG。發(fā)現(xiàn)它可在四環(huán)素調(diào)控下表達VP3并誘導(dǎo)HepG2凋亡。此理論為腫瘤的可控性基因治療提供了依據(jù)。此外Rv載體在治療艾滋?。?］、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?-10］等方面同樣具備巨大的應(yīng)用潛力。

2 腺病毒載體

2.1 腺病毒的結(jié)構(gòu)

腺病毒是無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，由殼粒呈二十面體排列構(gòu)成。衣殼內(nèi)的五聯(lián)體及纖毛頂端形成的頭節(jié)區(qū)能與細胞表面的病毒受體結(jié)合。腺病毒基因組中的蛋白VI與病毒衣殼連接在一起，在兩條鏈的5'端各結(jié)合DNA蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)，其與腺病毒復(fù)制密切相關(guān)。基因組編碼區(qū)分為早期基因區(qū)和晚期基因區(qū)，前者主要編碼病毒的調(diào)節(jié)蛋白，后者編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。第三代腺病毒載體去除了所有編碼基因，只保留了5'和3'末端反向末端重復(fù)序列及包裝信號。因此載體容量大，可攜帶36 kb DNA。

2.2 腺病毒載體的改良

腺病毒載體不整合入宿主細胞染色體，插入誘變的潛在風險比Lv小，還可感染分裂期和靜止期細胞，且能高效表達其基因產(chǎn)物。其缺點是難以持續(xù)表達，還可能誘發(fā)宿主體內(nèi)細胞免疫和體液免疫反應(yīng)而導(dǎo)致組織損傷和轉(zhuǎn)基因表達［11］。對此人們研制出刪除了所有編碼區(qū)基因的輔助依賴型腺病毒載體，其免疫原性、炎性反應(yīng)和細胞毒性均明顯降低。

2.3 腺病毒載體的應(yīng)用

腺病毒載體宿主范圍廣，包裝容量大，安全性好。因腺病毒能高效轉(zhuǎn)染多種細胞所以常作為基因轉(zhuǎn)移的載體［2］。在基因治療和疫苗載體等方面獲得廣泛應(yīng)用:孫士敏等［12］以脂質(zhì)體為介導(dǎo)將AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)的骨架質(zhì)粒pBHGIoxAEl、3Cre和穿梭質(zhì)粒pDC316-NS5B共轉(zhuǎn)染293細胞進行同源重組產(chǎn)生了重組腺病毒pAd-NS5B。成功構(gòu)建了表達HCV NS5B基因的重組腺病毒載體，為進一步探索HCV基因免疫和治療做了鋪墊。

Takeshi等［13］構(gòu)建的腺病毒載體包含RNA聚合酶-Ⅰ依賴的表達盒和四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)。依據(jù)四環(huán)素應(yīng)答元件和RNA聚合酶-Ⅰ啟動子制備了雜合啟動子，后者能促進HCV復(fù)制子進行擴增?？勺鳛镠CV復(fù)制的一個評估系統(tǒng)。

3 Lv載體

3.1 Lv的結(jié)構(gòu)

Lv屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科，其載體以HIV-I為基礎(chǔ)構(gòu)建。Lv載體還有4個輔助基因vif、vpr、nef和vpu及2個調(diào)節(jié)基因Tat和rev。其宿主范圍比Rv更廣，對難轉(zhuǎn)細胞其基因轉(zhuǎn)染率也較高。

3.2 Lv載體的構(gòu)建

Lv載體構(gòu)建的關(guān)鍵是將HIV-I基因組中的順式作用元件和編碼反式作用蛋白序列進行分離［14］。包裝成分與載體成分均含逆轉(zhuǎn)錄和HIV-I順式作用序列。包裝成分可分別構(gòu)建在兩質(zhì)粒上:其一表達gag和pol，另一個表達env。

3.3 Lv載體的優(yōu)點及應(yīng)用

Lv載體以其高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率成為研究者的新寵。其優(yōu)點是:(1)對分裂期和非分裂期細胞均能感染;(2)可整合入宿主細胞染色體實現(xiàn)長期而穩(wěn)定的表達;(3)可兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子［15］。

Lv載體為AIDS的基因治療帶來了福音，在其他系統(tǒng)疾病的治療中也顯現(xiàn)希望:Lesch-Nyhan綜合征因編碼次黃嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的基因缺陷而引起遺傳代謝性腦病。若能將攜帶HPRT基因的Lv注入體內(nèi)神經(jīng)元，很可能對此病產(chǎn)生良好療效。又如用Lv將多藥耐藥基因?qū)朐煅杉毎墒蛊淠褪茌^大劑量化療，對治療白血病及其它惡性腫瘤的療效有促進作用［16］。

4 AAV

4.1 AAV的結(jié)構(gòu)

AAV是無被膜的線狀單鏈DNA病毒?，F(xiàn)已分離出11種血清型AAV［17］。從人體中分離的AAV2研究最透徹，其基因組所含的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(inverted terminal repeat，ITR)是復(fù)制、整合和包裝所必需的順式作用元件，具有轉(zhuǎn)錄啟動子活性?；蚪M中Rep蛋白與位點特異性整合相關(guān)。cap基因編碼的3種衣殼蛋白與感染性病毒顆粒相關(guān)。重組AAV載體即由野生型AAV以目的基因取代病毒編碼序列(rep和cap)構(gòu)建而成。

4.2 AAV的優(yōu)缺點

AAV系統(tǒng)免疫原性低，能轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細胞，有整合到特殊位置的潛能。其廣泛的趨向性，能完成多種器官的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)［18］。然而重組AAV載體的包裝容量不足仍是限制其應(yīng)用的一個主要因素。不過有專家指出解決之道:共表達多基因的幾種策略中，合編入核糖體內(nèi)部進位點是擴容更為有效的策略［19-20］。

4.3 AAV載體的應(yīng)用

人群中AAV感染率很高但尚未發(fā)現(xiàn)該病毒是疾病的致病因素。Gorbatyuk等［21］于P23H基因突變鼠的視網(wǎng)膜下注射攜帶核酶Rz525的重組AAV2/5載體，12周后檢測到視網(wǎng)膜電圖a波和b波的振幅。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)分析也表明基因轉(zhuǎn)移能阻止視網(wǎng)膜外核層的變性。此外，重組AAV也是很有潛力的提高某些骨科疾病療效的基因轉(zhuǎn)移工具［22］。Larsen等［23］成功應(yīng)用重組AAV載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細胞。Zhang等［2］利用重組AAV攜帶血管內(nèi)皮因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因共轉(zhuǎn)染至兔骨髓間充質(zhì)干細胞獲得高表達，并且體內(nèi)試驗證實八周后能促使缺血患肢明顯成骨。FDA也證實一系列臨床實驗表明AAV2在治療某些人類疾病有效，包括炎癥性關(guān)節(jié)炎、癲癇、血友病B和肌營養(yǎng)不良等［24］。

5 桿狀病毒

5.1 桿狀病毒的結(jié)構(gòu)

桿狀病毒是有囊膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小為80～180 kb。其結(jié)構(gòu)特征是病毒粒子包埋于蛋白質(zhì)基質(zhì)的包涵體內(nèi)。病毒粒子形態(tài)分兩種:其一為出芽型病毒粒子，介導(dǎo)細胞與細胞間的感染;其二是包埋型病毒粒子，入侵腸上皮細胞。病毒DNA分子以超螺旋存在于桿狀核衣殼中。核衣殼又包括衣殼蛋白和髓核:前者是桿狀病毒粒子結(jié)構(gòu)蛋白，后者含病毒DNA和堿性蛋白。

5.2 桿狀病毒的改良

桿狀病毒可被血清中的補體成分滅活，抑制了其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。很多人正在探索改良之道:通過對其進行偽型桿狀病毒修飾，可抵抗補體的滅活作用，或在桿狀病毒多角體基因和重組載體上置入loxP位點也能提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。據(jù)λ噬菌體位點特異重組原理［25］，將attR位點置入桿狀病毒基因組可獲得BaculoDirectTM線性DNA。在含GatewayTMLR ClonaseTM酶的情況下，此基因組與外源基因重組后得到的系統(tǒng)速度快、效率高。

5.3 桿狀病毒優(yōu)點及應(yīng)用

桿狀病毒載體具有多項優(yōu)勢:(1)基因組載量大，可達38 kb?？赏瑫r表達多基因，甚至攜帶整個病毒基因組;(2)安全性高，對細胞無毒。重組桿狀病毒在人體細胞內(nèi)不能復(fù)制;(3)真核表達，其產(chǎn)物可行翻譯后修飾且能很快獲得高表達。

桿狀病毒表達載體現(xiàn)已成為基因工程四大表達系統(tǒng)之一［26］。并且很快被用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域:(1)單抗研制。以桿狀病毒的顆粒表面病原體為抗原蛋白，得到單克隆抗體。不用純化抗原就能直接免疫動物;(2)新型疫苗研制。將外源蛋白與桿狀病毒的囊膜蛋白融合，可作為疫苗誘導(dǎo)動物產(chǎn)生保護性免疫。Xu等［27］將豬瘟病毒E2糖蛋白與gp64蛋白融合之后用其免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)其產(chǎn)生E2中和性抗體;(3)可作為哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移載體。Kim等［28］發(fā)現(xiàn)桿狀病毒攜帶端粒逆轉(zhuǎn)錄酶能抑制小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長。劉正山等［29］用重組桿狀病毒(BacVCMV-EGFP)對小鼠、豬、恒河猴及人的BMSCs進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)BacVCMV-EGFP對恒河猴及人的BMSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)率明顯高于前兩者。表明重組桿狀病毒可作為靈長類動物BMSCs基因修飾的理想載體。

6 展望

病毒載體的應(yīng)用促進了很多領(lǐng)域的科研工作及臨床治療，其優(yōu)勢有利用病毒天然的感染性進入細胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高;復(fù)雜的裝配過程由細胞完成;不同病毒載體有不同表達特點。其缺點包括病毒應(yīng)用的安全性(細胞毒性、染色體毒性、免疫毒性等)、基因轉(zhuǎn)移中的靶向性(轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性、轉(zhuǎn)錄靶向性等)以及基因轉(zhuǎn)移的有效性(轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、基因表達水平、持續(xù)時間及表達的可調(diào)控性等)等問題。

Rv載體用于體內(nèi)治療時仍存在安全性及基因在宿主細胞中的調(diào)控等問題。如何提高病毒的感染效力并穩(wěn)定表達目的基因是今后研究逆轉(zhuǎn)錄載體的一大內(nèi)容;第三代腺病毒載體已廣泛用于多種動物實驗?zāi)Ｐ?，但臨床應(yīng)用進展較緩。其中AdF35是改進的了腺病毒亞型，因它能感染某些特殊細胞而日益受關(guān)注［30］;找出對靶細胞有親嗜性的重組AAV血清型，設(shè)計出組織特異性啟動子來提高重組AAV載體的轉(zhuǎn)染率和安全性可為基因治療帶來新希望;重組獲得可調(diào)控外源基因表達、靶向性強的Lv載體是今后應(yīng)用的方向;桿狀病毒在研制非復(fù)制型基因治療載體及疫苗方面極具應(yīng)用前景。今后將從提高轉(zhuǎn)染效率和表達水平及減少宿主對桿狀病毒的滅活作用等方面增強其在體內(nèi)存活力和穩(wěn)定性。隨著高效、安全的基因傳遞體系不斷被改良和研發(fā)，基因治療必將得到更廣泛的應(yīng)用。

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