復(fù)方瘡瘍搽劑中沒食子酸的含量測定

何方方

（河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開封 475001）お

摘 要：目的：建立復(fù)方瘡瘍搽劑中沒食子酸的含量測定方法。方法：采用HPLC,Kromasil C18色譜柱,流動相甲醇-0.025%磷酸水溶液(4∶96),柱溫；25℃，流速1mL/min,檢測波長275nm。結(jié)果：相關(guān)系數(shù)r=0.99972,精密度RSD為0.42%，平均加樣回收率為99.1%，RSD為0.91%，結(jié)果示線性關(guān)系良好。結(jié)論：該方法操作簡單,分離效果好,可用于復(fù)方瘡瘍搽劑的質(zhì)量控制。關(guān)鍵詞：復(fù)方瘡瘍搽劑；沒食子酸；高效液相色譜法

中圖分類號：R927.2文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1673-2197（2009）01-0040-02

復(fù)方瘡瘍搽劑由金銀花、大黃、五倍子、柯子、當(dāng)歸、黃柏、烏梅等組成。具有清熱解毒、斂瘡止血、抗菌消炎的功效。主要用于治療各種潰瘍、外傷出血、癰、腫、疔、癤等癥。方中五倍子、柯子、烏梅具有收斂止血、抗菌消炎之功效,其主要成分為沒食子酸，為瘡瘍搽劑中的有效成分之一。本實驗對樣品預(yù)處理后，用甲醇回流提取，采用HPLC 法對瘡瘍搽劑中的沒食子酸進行含量測定,以對其質(zhì)量進行控制。本法取樣量少，操作簡便，精密度高，分離良好。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 高效液相色譜儀; KromasilC18色譜柱;G1315B DAD檢測器；自動進樣器；四元泵；Agilent 1100 化學(xué)工作站。

1.2 試藥

沒食子酸對照品(0831-9501):中國藥品生物制品鑒定所;樣品:自制(批號:000213，000214，000215，000216，000217) ；甲醇：色譜純（天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；磷酸：分析純（廣東汕頭西隴化工廠）；所有色譜用試劑均用0.45μm微孔濾膜過濾；水為重蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 KromasilC18 250×4.6mm 5μm;流動相: 甲醇-0.025%磷酸水溶液(4∶96)^[1];流速1mL/min ;檢測波長275 nm；柱溫：25℃；進樣量:1μL；分析方法:外標(biāo)法。

2.2 檢測波長的選擇

取沒食子酸對照品適量,用流動相溶解并稀釋,于200～400nm 處進行UV 掃描,從其紫外圖譜中可見其在220nm、275 nm 處有最大吸收,但在220nm檢測波長下，流動相中甲醇及樣品中其他物質(zhì)的紫外吸收干擾較大，基線不穩(wěn)，故選擇275 nm 為檢測波長。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別按照2.5、2.6項下方法制備對照品溶液及供試品溶液，按2.1項下色譜條件，各進樣5μm，同時采集200~400nm光譜數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，供試品溶液相應(yīng)色譜峰的光譜與對照品沒食子酸一致，并經(jīng)Agilent 1100 化學(xué)工作站純度分析，色譜峰純度符合規(guī)定。沒食子酸對照品保留時間為10.7min，理論塔板數(shù)大于3 000。故將最小理論塔板數(shù)定為不低于3 000 。2.4 流動相的選擇

文獻報道沒食子酸的測定方法很多，主要以薄層掃描法和高效液相色譜法^[2、3]為主。參考文獻報道的方法試驗，流動相用甲醇-水（5∶95）,水-乙酸（98∶2），甲醇-冰醋酸-N，N二甲基酰胺-水（1∶3∶15∶81）^[4]，甲醇-0.5%冰醋酸（15∶85），在該制劑中沒食子酸的分離效果均不佳，初步選擇甲醇-0.025%磷酸水溶液（30∶70）作流動相，沒食子酸與其他組分色譜峰分離雖然較前幾種流動相效果好，但仍不佳，考慮到?jīng)]食子酸顯酸性，故流動相的pH值對沒食子酸的分離影響較大^[5]，通過不斷改變甲醇與磷酸水溶液的比例及流速，選定甲醇-0.025%磷酸水溶液(4∶96)及流速1mL/min比較合適，分離度好且保留時間適宜，而且在不斷調(diào)節(jié)pH值的過程中證明流動相的pH值確實對沒食子酸的分離影響較大。

2.5 對照品溶液的配制

精密稱取減壓干燥至恒重的沒食子酸對照品,加甲醇制成0. 108mg/mL的溶液,作為對照品溶液。供試品溶液的配制精密吸取樣品(批號:000213)10mL，水浴蒸干加甲醇10mL超聲處理300min，濾過,甲醇定容于10mL容量瓶中,搖勻即得。

2.6 供試品溶液的配制

精密吸取樣品(批號:000213) 10mL，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至7，過濾，濾液用氯仿萃取3次，每次10mL;棄去氯仿液，水液用稀鹽酸調(diào)pH值至3，過濾，濾液水浴蒸干；40mL甲醇回流30min,放冷，濾過，回收甲醇，定容于10mL容量瓶中，以0.45μm微孔濾膜濾過，備用。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取上述對照品溶液1、2、4、6、8、10μL進樣測定。以進樣量(μg) 為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)。測定結(jié)果,得到回歸方程為：Y = 4118.381X + 12.277854,相關(guān)系數(shù)：r=0.999 7，線性范圍：0.1038～1.038 2μg。

2.8 精密度實驗

精密吸取對照品溶液5μL，重復(fù)進樣5 次,進行精密度實驗。結(jié)果峰面積的RSD(n=5)=0.42%。證明本法有較高的精密度（見表1）。

2.9 穩(wěn)定性實驗

取同一批號本品（000213），按供試品項下方法處理后，分別于0、1、2、4、6h進樣，進樣量為2μL,測得其沒食子酸的平均峰面積值為2497，RSD為4.24%，表明樣品中沒食子酸的含量在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性實驗

取同一批號本品（000214），平行制備5份樣品，按樣品測定法測定，并對所得數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果測得沒食子酸平均含量為0.326mg/mL,RSD為0.59%。

2.11 樣品測定

取5批樣品依法制得供試品溶液，進樣量1μL,分別依法測定，按外標(biāo)法計算沒食子酸含量，結(jié)果見表2。

2.12 加樣收率實驗

精密吸取已知含量的樣品(批號為000216)10mL，分別加入沒食子酸對照品,依法處理制成供試品溶液,進樣測定,計算回收率,結(jié)果見表3,表明樣品中其他成分對實驗結(jié)果無顯著影響 。

3 討論

（1）該制劑中的五倍子、柯子、烏梅、大黃中均含有沒食子酸,且這4 味藥占組方的50%，沒食子酸又是其中一種有效成分。故為了保證藥品質(zhì)量及療效,必須測定沒食子酸的含量。

（2）樣品提取時，根據(jù)沒食子酸的溶解性及參考文獻，選用甲醇回流，放置過夜，超聲處理進行比較，結(jié)果表明甲醇回流效果最佳。對回流30、40、60min的結(jié)果比較，表明沒食子酸含量相差不大，故選用回流30min提取。

（3）由于沒食子酸為可水解鞣質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元，本篇樣品中沒食子酸的提取采用甲醇回流加熱提取，使樣品中可水解鞣質(zhì)水解出沒食子酸，因此本篇測定的是樣品中的游離沒食子酸和水解出的沒食子酸的總量之和^[6]。若采用超聲提取，提取的主要為游離沒食子酸，含量較低。

本篇通過實驗研究，建立了瘡瘍搽劑中沒食子酸含量的HPLC測定法，本法取樣量少，方法簡單，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為質(zhì)量控制分析方法，為沒食子酸的含量測定提供了一種可借鑒的、行之有效的方法。

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（責(zé)任編輯：陳涌濤）