慢病毒載體的構(gòu)建及其在基因治療方面的應(yīng)用

湯海濤　安春麗

摘 要：慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為RNA病毒。經(jīng)改造的慢病毒作為外源基因載體，具有其獨(dú)特的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)?；蛑委煶晒Φ年P(guān)鍵是選擇合適的載體系統(tǒng)，慢病毒載體作為一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，具有可感染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前基因治療載體研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)對(duì)其基礎(chǔ)生物學(xué)特性、載體改造及其應(yīng)用等研究均取得了較大進(jìn)展，筆者對(duì)慢病毒載體的構(gòu)建以及其在人類(lèi)疾病基因治療方面的應(yīng)用做簡(jiǎn)單的介紹。

關(guān)鍵詞：慢病毒載體；載體構(gòu)建；基因治療

中圖分類(lèi)號(hào)：R373文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）02-0142-03

基因治療是向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片段，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療的目的。其關(guān)鍵問(wèn)題之一是如何將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，得到穩(wěn)定、高效表達(dá)。理想的基因載體應(yīng)具備：靶向特異性；高度穩(wěn)定、易制備、可濃縮和純化；無(wú)毒性；有利于基因高效轉(zhuǎn)移和長(zhǎng)期表達(dá)；容量大，易人工合成，缺乏自動(dòng)復(fù)制載體自身的能力［１］。由于病毒基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子背景比較清楚、易于改造和操作、感染效率高、有較高靶細(xì)胞特異性，這些都是其他載體系統(tǒng)無(wú)法比擬的，而慢病毒載體由于其對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力且轉(zhuǎn)染效率高、靶向性好和持久性表達(dá)等特點(diǎn)，病毒載體系統(tǒng)就顯得格外引人注目。

1 慢病毒及其載體的簡(jiǎn)介

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env3個(gè)基本結(jié)構(gòu)基因外，還包含4個(gè)輔助基因vif、vpr、nef、vpu和2個(gè)調(diào)節(jié)基因tat和rev［２］。慢病毒載體（Lentiviral vector， LV）作為外源基因載體，其產(chǎn)生均包括一個(gè)遺傳割裂基因表達(dá)的設(shè)計(jì)。病毒元件要符合以下條件：①慢病毒組裝輔助蛋白至少含有g(shù)ag-pol基因；②慢病毒轉(zhuǎn)基因載體RNA包括轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒；③異質(zhì)糖蛋白。目前使用不同種屬來(lái)源的慢病毒載體，包括來(lái)源于人類(lèi)（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、貓（FIV）等其它物種［３］。

2 病毒載體的構(gòu)建

由于慢病毒的一些自身因素，我們需對(duì)其進(jìn)行以下的一些改建，使其可以更好地為疾病治療和科研工作服務(wù)。

2.1 最小輔助包裝元件

為了減少病毒序列的數(shù)量從而減少同源重組的風(fēng)險(xiǎn)，去除了組裝慢病毒載體結(jié)構(gòu)中不同輔助元件或用其它的特異序列來(lái)代替。其中包括原位癌激活基因序列的調(diào)整。另外，去掉附加或調(diào)節(jié)基因與gag-pol基因一樣，已在一些慢病毒載體設(shè)計(jì)中得以應(yīng)用［４］。

2.2 去掉附加基因

有幾個(gè)HIV-1基因（vif，vpr，vpu，nef）對(duì)體外病毒復(fù)制不重要，但對(duì)體內(nèi)病毒的致病性非常重要，甚至nef，vif，vpr整合在病毒顆粒內(nèi)從而促進(jìn)了載體的免疫原性。因此缺乏這些非重要基因時(shí)能夠有效生產(chǎn)慢病毒載體是非常重要的［５］。然而，有研究表明在駐留型巨噬細(xì)胞和活性Ｂ淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)中需要nef，vif，vpr的參與［６］。因此，在去掉附加基因的過(guò)程中，要依具體情況決定基因的去留。

2.3 去除調(diào)節(jié)基因

有研究表明反式作用元件tat對(duì)全效慢病毒載體基因組RNA中的5-LTR的tat依賴(lài)性U3序列已經(jīng)被強(qiáng)效啟動(dòng)子序列取代。在安全性方面，通過(guò)在分散結(jié)構(gòu)中進(jìn)一步分裂原病毒基因組來(lái)表達(dá)rev。在設(shè)計(jì)雙順?lè)醋觛ag-pol，IRES，rev組裝表達(dá)結(jié)構(gòu)時(shí)也表達(dá)了rev基因結(jié)構(gòu)。載體與rev效應(yīng)元件（RRE）相互作用并影響了非剪接gag-pol mRNAs和轉(zhuǎn)基因載體基因組RNA從核內(nèi)輸出。RRE序列已被異種病毒序列所取代，此種病毒序列能促進(jìn)非剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從核中輸出或促進(jìn)非剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性。用這些異種輸出序列取代RRE/rev引起了HIV-1或SIV載體效價(jià)的下降［７］。另外，實(shí)驗(yàn)表明宿主細(xì)胞因子參與了RRE包含的RNAs從核中輸出的過(guò)程。

2.4 殼體化位點(diǎn)的最低要求

在大多數(shù)慢病毒載體殼體化位點(diǎn)要求在轉(zhuǎn)移載體RNA中存在gag基因區(qū)的最小5'-片段，此片段含有對(duì)順式組裝活性有必要的主干環(huán)結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)慢病毒載體體系中，包含在N-末端片段落gag ORF，大約有300~400個(gè)堿基對(duì)，已經(jīng)被移碼突變截?cái)啵虼艘赘谐尸F(xiàn)gag肽的轉(zhuǎn)錄/翻譯不會(huì)干預(yù)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯［８］。

3 慢病毒載體在疾病治療方面的應(yīng)用

慢病毒載體在基因治療方面已取得了良好的效果，國(guó)外已經(jīng)進(jìn)行了一系列的從基礎(chǔ)到臨床的系統(tǒng)研究工作，包括構(gòu)建有效載體所需的最少的HIV-1基因、SIN載體的構(gòu)建、應(yīng)用HIV-1載體包裝細(xì)胞系、非人類(lèi)慢病毒載體的應(yīng)用等；尤其是在安全性方面，在用H1V-1為載體的體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中，迄今尚未發(fā)現(xiàn)誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，表明其安全性是有保證的。

3.1 腫瘤治療

大約30%的乳腺癌中有表皮生長(zhǎng)因子受體家族蛋白HER₂的過(guò)表達(dá)，HER₂表達(dá)水平與病人的預(yù)后以及惡性程度密切相關(guān)。在以往鑒定的對(duì)HER₂有良好RNAi效應(yīng)的靶序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一系列U₆和H雙啟動(dòng)子小干擾RNA（siRNA）表達(dá)載體［９］，并轉(zhuǎn)染HER₂高表達(dá)乳腺癌SKBR3細(xì)胞定量測(cè)定了其HER₂下調(diào)效應(yīng)。程連勝［１０］等做siRNA表達(dá)盒經(jīng)LR重組反應(yīng)被克隆入慢病毒載體中并成功包裝成病毒的實(shí)驗(yàn)。由于siRNA是作用于mRNA上并導(dǎo)致其降解的，采用熒光定量PCR對(duì)感染siRNA慢病毒后乳腺癌SKBR₃細(xì)胞HER₂的mRNA水平進(jìn)行了相對(duì)定量、蛋白印跡雜交和流式細(xì)胞儀等一系列實(shí)驗(yàn)證明：慢病毒介導(dǎo)的RNAi確實(shí)能有效地下調(diào)腫瘤抗原HER₂的表達(dá)，結(jié)果顯示，由于HER₂下調(diào)導(dǎo)致了細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。由此可見(jiàn)，用慢病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)乳腺癌的治療將有良好的應(yīng)用前景。

自身分泌活動(dòng)因子（AMF）是由腫瘤細(xì)胞分泌的，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。AMP和其受體（AMPR）的表達(dá)與許多低成活率和進(jìn)行性的胃癌、結(jié)腸直腸癌、膀胱癌、食道癌、皮膚惡性黑色素瘤和肺腺癌有著密切的關(guān)系［１１-１７］。最近有研究表明，AMP的突變對(duì)乳腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有著明顯的促進(jìn)作用。AMP表現(xiàn)出了與磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的一致的序列，它受小窩蛋白-1（Cav-1）的負(fù)向調(diào)節(jié)［１８］。Kojic［１９］等用慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Cav-1基因到乳腺癌細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AMP的表達(dá)與Cav-1的表達(dá)有著明顯的負(fù)相關(guān)性，Cav-1對(duì)AMP有強(qiáng)負(fù)調(diào)節(jié)作用，對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。由此可推斷，慢病毒載體介導(dǎo)的Cav-1對(duì)與AMP表達(dá)相關(guān)的惡性腫瘤應(yīng)該有一定的治療效果。

3.2 血液系統(tǒng)疾病的治療

慢病毒載體不僅能感染造血干細(xì)胞（HSCs），使攜帶的目的基因整合至HSCs基因組內(nèi)，且能利用病毒攜帶的調(diào)控元件，使目的基因隨HSCs細(xì)胞特異性表達(dá)。Michel Sadelain［２０］等用小鼠模擬了人α-地中海貧血的模型，并用慢病毒載體介導(dǎo)治療基因進(jìn)行治療。實(shí)驗(yàn)載體來(lái)源于TNS9 vector，這個(gè)載體已表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)移治療用的人類(lèi)β-globin基因進(jìn)入小鼠造血干細(xì)胞的能力［２１-２４］。對(duì)α-地中海貧血，除了將β-globin基因用α-globin基因替代外，原載體的原件都保留，將載體通過(guò)小鼠卵黃囊的血管直接注射進(jìn)胚胎，但是轉(zhuǎn)移進(jìn)去的基因在表達(dá)過(guò)程中出現(xiàn)了衰減現(xiàn)象［２０］，原因還有待于研究。但在對(duì)β-地中海貧血的治療中，慢病毒介導(dǎo)的β-globin基因進(jìn)入小鼠的造血干細(xì)胞卻取得了不錯(cuò)的效果［２５］。雖然慢病毒載體在地中海貧血治療中不盡完美，但可以肯定的是，隨著研究的深入，慢病毒載體在地中海貧血中的應(yīng)用一定會(huì)有光明前景。

3.3 半月板的修復(fù)

張經(jīng)緯等［２６］用ViraPower慢病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)載中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，研究其在新西蘭大白兔的半月板纖維軟骨細(xì)胞損傷修復(fù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染48h后半月板細(xì)胞培養(yǎng)液中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子就有明顯的表達(dá)；細(xì)胞DNA合成前期、DNA合成期、分裂前期及分裂期的時(shí)間較對(duì)照組和空白組縮短，并且膠原合成結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膠原高于對(duì)照組和空白組。表明利用慢病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)能有效地將堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染入半月板纖維軟骨細(xì)胞，繼而促進(jìn)半月板細(xì)胞的增殖和基質(zhì)合成，有可能為治療半月板損傷提供新的方法。

總之，盡管慢病毒載體目前還不盡完善，仍然存在很多的問(wèn)題，但是由于慢病毒載體可轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)移基因片段容量較大、目的基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因的治療和研究有很大的誘惑力。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步，該類(lèi)載體將會(huì)得到進(jìn)一步提高，并具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：姜付平）