局部應(yīng)用L-精氨酸對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響

陳曉華 于攀 李世榮 王珍祥

局部應(yīng)用L-精氨酸對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響

陳曉華 于攀 李世榮 王珍祥

目的研究局部應(yīng)用L-精氨酸對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面治療效果的影響。方法建立鏈脲霉素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠創(chuàng)面模型；昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組）、糖尿病對(duì)照組（B組）、糖尿病精氨酸治療組（C組），糖尿病小鼠創(chuàng)面模型建立后,觀察及測(cè)量傷后0、4、8、14、16 d時(shí)創(chuàng)面愈合面積、肉芽生長(zhǎng)情況、組織形態(tài)學(xué)改變、羥脯氨酸（OHP）含量。結(jié)果C組創(chuàng)面愈合明顯加快（P＜0.05），創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量、膠原生成增多，OHP含量增加。結(jié)論局部應(yīng)用L-精氨酸，通過(guò)加快肉芽生成，增加創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量，能促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。

糖尿病L-精氨酸創(chuàng)面愈合一氧化氮

糖尿病創(chuàng)面具有愈合明顯延遲的現(xiàn)象，在其分子機(jī)制中一氧化氮（Nitric Oxide，NO）占了很重要的地位[1]。L-精氨酸是NO合成的唯一底物，口服精氨酸可改善傷口愈合，增加創(chuàng)傷部位膠原含量和組織抗張強(qiáng)度[2]，但其局部應(yīng)用對(duì)于糖尿病創(chuàng)面愈合的影響報(bào)道較少。本研究擬通過(guò)對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面局部應(yīng)用精氨酸，探討其可否促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的修復(fù)及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

SPF昆明小鼠75只，體重（27±2）g（第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。L-精氨酸（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），STZ（Sigma公司），戊巴比妥鈉（Merk公司），OHP含量測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 糖尿病創(chuàng)傷模型的建立[3-4]

將小鼠連續(xù)5 d腹腔注射STZ（45 mg/kg），第5次注射后，小鼠禁食不禁水10 h，由小鼠尾靜脈取血，快速血糖儀測(cè)量空腹血糖水平?？崭寡菨舛雀哂?1.1 mmol/L，且連續(xù)出現(xiàn)多飲、多食、多尿者選為糖尿病模型小鼠。如血糖濃度低于11.1 mmol/L，以同樣濃度STZ注射3 d繼續(xù)誘導(dǎo)，使其血糖濃度高于11.1 mmol/L。模型建立后4周，小鼠背部10%硫化鈉脫毛，溫水清洗，拭干。次日，以戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用組織剪在小鼠背部剪去直徑約1 cm的圓形皮膚組織。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥[5]

將L-精氨酸溶解于去離子水中，制成濃度為100 g/L的溶液。動(dòng)物分為3組：正常對(duì)照組（A組）、糖尿病對(duì)照組（B組）和糖尿病精氨酸治療組（C組），每組25只小鼠。每天在C組小鼠創(chuàng)面噴灑注射L-精氨酸溶液0.15 mL，A組和B組創(chuàng)面使用同量的去離子水。

1.4 計(jì)算創(chuàng)面愈合率

于傷后0、4、8、14、16 d時(shí)測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。測(cè)量方法是用透明方格紙描繪創(chuàng)口，掃描入電腦后，以Adobe Photoshop CS2測(cè)量創(chuàng)面面積。

1.5 標(biāo)本取材及處理

每組動(dòng)物分別于傷后第4、8、14天切取愈合創(chuàng)面組織，固定于4%多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片，沿凸起最高點(diǎn)縱行切片，切片厚5 μm，行常規(guī)HE染色。

1.6 創(chuàng)面組織中OHP含量測(cè)定

創(chuàng)面組織準(zhǔn)確稱(chēng)重后，加9倍等滲鹽水制成10%的勻漿，離心，將上清稀釋成2%的濃度，按OHP含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料數(shù)據(jù)以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠創(chuàng)面模型的建立

STZ（45 mg/kg）注射后第4周，小鼠空腹血糖濃度為（20.62±1.23）mmol/L，沒(méi)有動(dòng)物死亡，且連續(xù)出現(xiàn)多食、多飲、多尿癥狀。對(duì)各組小鼠實(shí)施創(chuàng)面形成術(shù)后，動(dòng)物無(wú)死亡。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)A、C組肉芽組織生成好，炎癥反應(yīng)輕，創(chuàng)面上皮化時(shí)間早，到創(chuàng)傷后第14天基本完全愈合，且皮膚張力強(qiáng)度同正常皮膚；實(shí)驗(yàn)B組肉芽組織色暗、水腫，生長(zhǎng)不良，炎癥反應(yīng)較重，創(chuàng)面愈合延遲，且皮膚張力較低（圖1）。

2.3 組織學(xué)觀察

光鏡下可見(jiàn)創(chuàng)傷后A組和C組成纖維細(xì)胞數(shù)量較多，血管增生及膠原形成活躍。至創(chuàng)傷后第14天，成熟成纖維細(xì)胞增多，細(xì)胞排列成束狀，炎癥細(xì)胞很少。B組愈合過(guò)程中有較多炎性細(xì)胞，新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞及膠原生成較另兩組少，創(chuàng)傷后第14天成纖維細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞較另兩組多（圖2）。

圖1 創(chuàng)傷后第8天各組創(chuàng)面情況

圖2 創(chuàng)傷后第8天各組HE染色（400×）

2.4 創(chuàng)面愈合率

B組比A組愈合明顯延遲；C組與B組相比，在傷后第4天創(chuàng)面愈合率顯著增加（P＜0.05）（表1）。

表1 各組創(chuàng)面愈合率的比較(%，X±S，n=8)

2.5OHP含量

3組創(chuàng)面羥脯氨酸水平在創(chuàng)面形成后即明顯下降，之后逐漸增高。創(chuàng)面形成后第4天起各時(shí)相點(diǎn)A、C組的羥脯氨酸水平均顯著高于B組（表2）。

表2 各組羥脯氨酸含量比較(mg/g，X±S，n=3)

3 討論

L-精氨酸是體內(nèi)蛋白氮重要的載體、一種條件必需氨基酸，其可經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)、精氨酸酶生成一氧化氮（NO）、脯氨酸等活性分子，對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[6]。NO可參與并促進(jìn)皮膚組織創(chuàng)傷恢復(fù)的整個(gè)過(guò)程[7]，其作用表現(xiàn)在誘導(dǎo)成纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的增殖與分化、增進(jìn)血管生成、參與基質(zhì)的沉積和重塑、調(diào)節(jié)創(chuàng)傷愈合炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的活性等。有研究表明在創(chuàng)傷后糖尿病小鼠皮膚組織中NO生成明顯減少[8]。本研究采用局部應(yīng)用L-精氨酸的方法觀察其對(duì)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的影響，結(jié)果表明：精氨酸對(duì)糖尿病創(chuàng)面具有明顯的促愈作用。實(shí)驗(yàn)C組創(chuàng)面愈合率明顯高于B組，創(chuàng)傷后創(chuàng)面快速收縮，肉芽組織形成良好；在愈合晚期，創(chuàng)面愈合時(shí)間提前2～3 d，并呈現(xiàn)更好的皮膚愈合及毛發(fā)生長(zhǎng)。

在局部應(yīng)用L-精氨酸后，實(shí)驗(yàn)C組成纖維細(xì)胞增殖較快，膠原纖維排列較整齊，炎癥反應(yīng)發(fā)生較B組發(fā)生早。糖尿病創(chuàng)面炎癥反應(yīng)的延遲和失調(diào)是其難愈的主要原因之一[9]。局部應(yīng)用L-精氨酸可使創(chuàng)面中延遲出現(xiàn)的炎癥反應(yīng)得到改善，表明其經(jīng)一氧化氮合成酶(NOS)途徑產(chǎn)生NO，可影響創(chuàng)面早期的炎癥反應(yīng)等。

羥脯氨酸是膠原蛋白的重要組成部分，對(duì)膠原合成、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、創(chuàng)面修復(fù)和組織重塑至關(guān)重要，其含量可以反映創(chuàng)傷愈合的狀況。創(chuàng)傷后第4天開(kāi)始C組明顯高于B組，表明局部應(yīng)用L-精氨酸可促進(jìn)膠原合成，從而加快創(chuàng)面愈合。

本研究通過(guò)簡(jiǎn)單的方法建立了穩(wěn)定的糖尿病小鼠創(chuàng)面模型，證實(shí)了局部應(yīng)用L-精氨酸可通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成及改善創(chuàng)面炎性反應(yīng)延遲，明顯促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合。

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Effect of L-arginine on the Wound Healing of Diabetic Mice

CHEN Xiaohua1,YU Pan2,LI Shirong2,WANG Zhenxiang2.
1 Shanghai Time Plastic Surgery Hospital,Shanghai 200021,China;2 Department of Plastic Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.

ObjectiveTo investigate the effect of L-arginine used in the wound of mice with diabetes.MethodsType I DM mice induced by streptozotocin were used as the animal model.Seventy five male KM mice were used in this study and were randomly divided into group A(normal control,n=25),group B(diabetic control,n=25)and group C(diabetes with L-arginine administration,n=25).The percentage of healing areas,the granulation tissue formation,the histological and morphological changes and the content of hydroxyproline were observed and measured on the 0,4,8,14,and 16 days after injury.ResultsThe treatment group C showed better wound healing than the group B.The contents of fibroblasts,collagen and OHP increased,compared with those in the group B(P＜0.05).ConclusionThe local application of L-arginine could promote the healing of wounds in diabetic mice by stepping up the granulation tissue formation and increasing fibroblasts quantity in trauma.

Diabetes;L-arginine;Wound healing;Nitric Oxide

R619+.6

A

1673-0364（2009）04-0205-03

2009年3月29日；

2009年5月9日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.007

200021上海市上海時(shí)光整形外科醫(yī)院（陳曉華）；400038重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院整形外科（于攀，李世榮，王珍祥）。