SFRP 2與Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成機(jī)制中的研究

王珍祥 袁順宗 陶熹 李世榮 吳軍

SFRP 2與Periostin的相互作用在瘢痕疙瘩形成機(jī)制中的研究

王珍祥 袁順宗 陶熹 李世榮 吳軍

目的利用pull-down技術(shù)驗(yàn)證凋亡相關(guān)蛋白基因SFRP 2（Secreted frizzled-related protein 2）和骨母細(xì)胞特異性因子-2 Periostin（Osteoblast-specific factor 2）間的相互作用。方法構(gòu)建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)帶HA標(biāo)簽的Periostin融合蛋白（HA-Periostin）的重組載體pCMV-HA-Periostin，經(jīng)酶切鑒定正確后，和表達(dá)帶Myc標(biāo)簽的融合蛋白（Myc-SFRP 2）的重組真核表達(dá)載體pCMV-HA-SFRP2，單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞，利用pull-down技術(shù)驗(yàn)證Periostin與SFRP 2間的相互作用。結(jié)果成功構(gòu)建重組載體pCMV-HA-Periostin，與抗Myc單克隆抗體沉淀Myc-SFRP 2相互作用蛋白復(fù)合物后，可以檢測(cè)到HA-Periostin的表達(dá)。通過體外蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Periostin與SFRP 2間的相互作用。結(jié)論成功構(gòu)建帶HA標(biāo)簽的Periostin融合蛋白（HA-Periostin）的重組載體，利用pull-down技術(shù)證實(shí)了Periostin與SFRP 2間的存在相互作用。

凋亡相關(guān)蛋白基因骨母細(xì)胞特異性因子-2相互作用

瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡功能抑制的相關(guān)信號(hào)途徑研究，尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道[1]。本課題組對(duì)同體瘢痕疙瘩和正常皮膚內(nèi)差異表達(dá)的基因進(jìn)行了基因芯片篩選，確定了顯著高表達(dá)基因SFRP 2（Secreted frizzled-related protein 2)[2]。進(jìn)一步在原代培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞中，利用RTPCR技術(shù)從基因水平上證實(shí)SFRP 2基因在前者中的表達(dá)要顯著高于后者。SFRP 2蛋白可能是調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的新的重要信號(hào)分子。但是，SFRP 2如何在成纖維細(xì)胞中發(fā)揮其抑制凋亡功能尚不清楚。我們利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)SFRP 2的相互作用蛋白進(jìn)行初步篩選，獲得了一個(gè)能間的相互作用。分別構(gòu)建了SFRP 2的融合蛋白Myc-SFRP 2和Periostin的融合蛋白HA-Periostin的表達(dá)載體pCMV-HA-SFRP 2和pCMV-HA-Periostin，驗(yàn)證構(gòu)建成功后，利用免疫共沉淀驗(yàn)證SFRP 2與Periostin間是否存在相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、含SFRP 2基因序列的重組載體pCMV-Myc-SFRP 2和含Periostin編碼序列的重組載體pACT2-Periostin均為本課題組保存。pCMVHA載體、Myc單抗和HA多抗購自美國Clontech公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及化學(xué)發(fā)光液購自武漢博士德公司，細(xì)胞裂解液RIPA購自美國Santa Cruz公司，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及其檢測(cè)抗體購自日本TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美國Omega公司；DNA、蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自北京鼎國生物技術(shù)公司；Anti2Syntro2phin單抗、ECL Western印跡檢測(cè)試劑盒購自美國Chemicon公司。1.2方法

1.2.1 重組載體pCMV-HA-Periostin的構(gòu)建

分別根據(jù)pACT2-Periostin和空載體pCMVHA的特點(diǎn)，進(jìn)行Sfi I和Xho I雙酶切；0.6%瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物后，切割含目的片段和載體的凝膠，回收；T4 DNA連接酶轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒擴(kuò)增，用Sfi I和Xho I雙酶切鑒定，并凝膠電泳酶切。

1.2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.2.1 GST-SFRP2融合蛋白在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中，按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法[12]得到純化的融合蛋白瓊脂糖株，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 His-Periostin融合蛋白在宿主菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將保存的重組表達(dá)載體pACT2-Periostin轉(zhuǎn)化到宿主菌中，按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法[12]收集上清，即為含有His-Periostin融合蛋白的細(xì)菌裂解液，每管1 mL分裝待用或-80℃保存。

1.2.3 瘢痕疙瘩組織裂解液的制備

取瘢痕疙瘩組織，用冰冷的PBS洗凈，每克組織中加入10 mL裂解液，然后用勻漿器冰浴、離心，取上清即為瘢痕疙瘩組織裂解液。

1.2.4 GST pull-down

將等量純化的GST和GST-SFRP 2分別加入1 mL瘢痕疙瘩組織裂解液中，4℃持續(xù)混和3 h。按常規(guī)方法處理，收集沉淀，即為GST pull-down沉淀復(fù)合物。

1.2.5 Western印跡

參照文獻(xiàn)[3]的方法，電泳，蛋白轉(zhuǎn)移，加入抗His標(biāo)簽的抗體，洗膜二抗孵育，參照ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書于暗室內(nèi)發(fā)光曝光。

2 結(jié)果

2.1 重組載體pCMV-Myc-SFRP 2和pCMV-HAPeriostin的鑒定

經(jīng)酶切、電泳后獲得的圖譜顯示(圖1)，近800 bp處的條帶為酶切后的目的片段SFRP 1編碼基因（圖1，條帶3），近2 500 bp處的條帶為酶切后的目的基因Periostin(圖2，條帶2)，表明pCMV-Myc-SFRP 2和pCMV-HA-Periostin分別構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均一致。

圖1 pCMV-Myc-SFRP 2重組載體酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 pCMV-HA-Periostin重組載體酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 利用pull-down再次證實(shí)SFRP 2和Periostin間存在相互作用

經(jīng)pull-down實(shí)驗(yàn)顯示，在單獨(dú)加入GST-SFRP 2融合蛋白或His-Periostin融合蛋白的細(xì)菌裂解液到瘢痕疙瘩組織裂解液中時(shí)，僅僅顯示自身1個(gè)條帶，沒有相互作用，而一旦同時(shí)加入GST-SFRP 2融合蛋白和His-Periostin融合蛋白的細(xì)菌裂解液到瘢痕疙瘩組織裂解液中，不管是His pull-down還是GST pull-down，都檢測(cè)出GST-SFRP 2和His-Periostin兩個(gè)條帶，說明它們存在相互作用（圖3）。

圖3 分別利用His pull-down和GST pull-down技術(shù)證實(shí)SFRP 2和Periostin間存在相互作用

3 討論

凋亡在創(chuàng)傷愈合中具有重要作用，隨著細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解，細(xì)胞的增殖和凋亡保持平衡。而瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞的凋亡和增殖發(fā)生改變，大量研究表明KFs的凋亡率要低于NFs，其中已證實(shí)p53、p63和p73參與了病理性瘢痕的發(fā)展，尤其是p53在瘢痕疙瘩中的表達(dá)要遠(yuǎn)高于在正常和增生性瘢痕中的表達(dá)，且p53的突變能夠引起KFs的凋亡[4]。因此，創(chuàng)傷愈合過程中成纖維細(xì)胞的活化、增殖、凋亡抑制，以及其分泌的膠原引起細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積，是引起瘢痕疙瘩的主要病理機(jī)制。目前已證實(shí)的TGF-β、PDGF、CTGF和p53等分子的功能可部分揭示瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也有研究表明瘢痕疙瘩中還存在著其他更多的分子信號(hào)機(jī)制[5-6]。

SFRP 2位于4q31.3，其全長約2 kb，表達(dá)于胞漿，也可分泌至胞外，其主要功能為抑制細(xì)胞凋亡。SFRP 2通過調(diào)控Wnt信號(hào)發(fā)揮其調(diào)節(jié)細(xì)胞抗凋亡的作用[7]。在進(jìn)一步對(duì)纖維化相關(guān)的基因芯片篩選和差異蛋白表達(dá)的文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上，我們認(rèn)為SFRP 2在瘢痕疙瘩中可能具有更重要的功能，其原因在于：①另一研究小組利用基因芯片技術(shù)篩選了同體瘢痕疙瘩和正常皮膚的差異表達(dá)基因，結(jié)果表明在所篩選出與凋亡相關(guān)的基因中，SFRP 2基因在瘢痕疙瘩中也呈顯著高表達(dá)[8]；②從瘢痕疙瘩分離的成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)經(jīng)氫化可的松處理前后，表達(dá)變化同樣存在著明顯差異。

Periostin，即骨母細(xì)胞特異性因子2（Osteoblastspecific factor 2，OSF-2），位于人染色體13q13.3，全長約3 kb，編碼一個(gè)大小為90 kD左右的可溶性胞漿蛋白質(zhì)。該蛋白可分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)揮作用。既往研究表明，Periostin能夠促進(jìn)Ⅰ型膠原的生成，在以瘢痕疙瘩為代表的纖維化疾病中可能具有非常關(guān)鍵的功能，其主要原因在于：①瘢痕疙瘩與正常皮膚組織的基因芯片篩選結(jié)果顯示，Periostin在瘢痕疙瘩中高表達(dá)[10-11]；②在蛋白水平上，與正常組織相比，瘢痕疙瘩組織中Periostin在蛋白水平上的表達(dá)同樣表現(xiàn)為增高；③Periostin基因敲除后會(huì)導(dǎo)致心肌創(chuàng)傷愈合時(shí)成纖維細(xì)胞數(shù)量減少、膠原原纖維形成受損，引起心肌纖維化修復(fù)失敗，并且Periostin可通過PI3K、MAPK和整合素等下游分子調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖；④Periostin與Ⅰ型膠原蛋白間存在相互作用，調(diào)控真皮結(jié)締組織中膠原原纖維的形成。故Periostin在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)增高，是瘢痕相關(guān)基因；Periostin蛋白在瘢痕疙瘩形成中可能發(fā)揮重要作用[9]。

本實(shí)驗(yàn)分別成功構(gòu)建了SFRP 2的融合蛋白Myc-SFRP 2和Periostin的融合蛋白HA-Periostin的表達(dá)載體pCMV-HA-SFRP 2和pCMV-HAPeriostin。近800 bp處的條帶為酶切后的目的片段SARP 1編碼基因，近2 500 bp處的條帶為酶切后的目的基因Periostin。隨后，利用His pull-down及GST pull-down驗(yàn)證一旦同時(shí)加入GST-SFRP 2融合蛋白和His-Periostin融合蛋白的細(xì)菌裂解液到瘢痕疙瘩組織裂解液中，不管是His pull-down還是GST pull-down，都檢測(cè)出GST-SFRP 2和His-Periostin兩個(gè)條帶，說明Periostin和SFRP 2間存在相互作用?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道也表明Periostin和SFRP 2在瘢痕疙瘩、器官纖維化中的表達(dá)與正常組織相比，二者在基因水平上均同時(shí)表達(dá)增高[11]；SFRP 2的功能以抑制成纖維細(xì)胞凋亡為主，Periostin的功能以調(diào)控成纖維細(xì)胞的膠原生成占主導(dǎo)，這些功能便與瘢痕疙瘩形成的主要分子機(jī)制即成纖維細(xì)胞凋亡受抑和活化的成纖維細(xì)胞生成、分泌膠原過多相對(duì)應(yīng)，提示SFRP 2和Periostin間的相互作用可能是瘢痕疙瘩形成中的重要分子機(jī)制。

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Experimental Study of Interaction between SERP 2 and Periostin in the Formation of Keloid

WANG Zhenxiang, YUAN Shunzong,TAO Xi,LI Shirong,WU Jun.Department of Plastic Surgery and Institute of Burn,Southwest Hospital, Affiliated Third Military Medical University,Chongqing 400038,China.Corresponding author:LI Shirong,WU Jun.

ObjectiveTo investigate the interaction between Periostin（osteoblast-specific factor 2）and SFRP 2(Secreted frizzled-related protein 2)in the formation of keloid.MethodsHA-tagged fusion protein(HA-Periostin)expression vector was constructed,identified and transfected into human embryo kidney 293(HEK293)cells alone or with Myc-tagged fusion protein(Myc-SFRP 2)expression vector pMCV-Myc-SFRP 2.The interaction between SFRP 2 and Periostin was detected by pull-down technique.ResultsDouble restriction enzyme digestion showed that pCMV-HA-Periostin was constructed successfully.When Myc-SFRP 2 was immunoprecipitanted,HA-Periostin was identified.And the interaction between SFRP 2 and Periostin was found by GST pull-down and His pull-down technique.ConclusionThe recombinant vector pCMV-HAPeriostin was constructed successfully.The interaction between SFRP 2 and Periostin could be identified by GST pull-down and His pull-down.

Secreted frizzled-related protein 2;Periostin;Interaction

R619+.6

A

1673－0364（2009）04－0199－04

2009年5月20日；

2009年7月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.005

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目（G1999054204）。

400038重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院整形外科。

李世榮，吳軍。