不同濃度配比的殼聚糖-膠原復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞親和性的影響

楊漾 鄧丹 劉偉 楊瑤?kù)?/p>

·論著·

不同濃度配比的殼聚糖-膠原復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞親和性的影響

楊漾 鄧丹 劉偉 楊瑤?kù)?/p>

目的評(píng)價(jià)不同濃度配比的殼聚糖-膠原支架材料對(duì)細(xì)胞親和性的影響，并觀察在細(xì)胞－支架復(fù)合物培養(yǎng)過(guò)程中支架材料的物理性質(zhì)變化情況。方法采用第3代正常人皮膚成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)和擴(kuò)增至足夠數(shù)量后，分別種植于100%膠原（實(shí)驗(yàn)組1）、70%膠原（殼聚糖∶膠原＝3∶7，實(shí)驗(yàn)組2）、50%膠原（殼聚糖∶膠原＝5∶5，實(shí)驗(yàn)組3）、30%膠原（殼聚糖∶膠原＝7∶3，實(shí)驗(yàn)組4）四種不同濃度配比的殼聚糖-膠原復(fù)合支架材料上，培養(yǎng)7 d，通過(guò)光鏡、電鏡等觀察和比較細(xì)胞在支架上的黏附情況、增殖活力和生長(zhǎng)形態(tài)，以及材料物理強(qiáng)度的變化情況。結(jié)果不同濃度的各組殼聚糖-膠原支架材料上，細(xì)胞均能黏附、生長(zhǎng)良好，其中實(shí)驗(yàn)組2的多孔支架材料上細(xì)胞增殖更接近單純膠原材料（實(shí)驗(yàn)組1），且材料收縮降解速度明顯低于其他2組。結(jié)論不同濃度配比的殼聚糖-膠原支架材料中，殼聚糖∶膠原=3∶7的復(fù)合支架材料具有良好的三維空間結(jié)構(gòu)和細(xì)胞相容性，且材料形變相對(duì)較小。

殼聚糖膠原人皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞親和性

組織工程學(xué)的研究涉及種子細(xì)胞、支架材料和組織構(gòu)建等方面。其中，支架材料是組織工程研究的重要領(lǐng)域之一[1]。殼聚糖是幾丁質(zhì)的脫乙酞化產(chǎn)物，是細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖(GAG)的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，具有生物相容性良好、低抗原性、可生物降解等特點(diǎn)，但其細(xì)胞親和力不夠理想，制約了其在組織工程研究中的應(yīng)用[2]。膠原具有良好的細(xì)胞親和力，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，但降解快，不能與細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相匹配，且強(qiáng)度較低[3]。將膠原與殼聚糖復(fù)合，使得制備的殼聚糖復(fù)合支架上分布有大量的膠原纖維絲構(gòu)成的網(wǎng)，有可能改善這兩種材料的生物學(xué)性能，在提高細(xì)胞親和力的同時(shí)，使材料的降解速度與組織形成時(shí)間相匹配，并提高材料的物理學(xué)強(qiáng)度。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們驗(yàn)證了不同濃度配比下的殼聚糖-膠原膜片的細(xì)胞親和性差異、降解情況以及復(fù)合材料的物理學(xué)性能，為將來(lái)應(yīng)用該復(fù)合材料構(gòu)建組織工程化組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 人皮膚成纖維細(xì)胞獲取

人體皮膚來(lái)源于包皮環(huán)切術(shù)獲取的正常小兒包皮（4～15歲），以磷酸鹽緩沖液（PBS，含青霉素、鏈霉素各1 000 000 U/L）沖洗數(shù)遍，再以0.25%的氯霉素溶液浸泡20～30 min。刮除表皮并剪去皮下脂肪，剪碎成2 mm3的小塊后置于50 mL的離心管內(nèi)，加入0.1%的Ⅰ型膠原酶30 mL，置于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化，約2 h后收集過(guò)濾后的消化懸液，1 500 rpm離心5 min，獲取原代細(xì)胞，加入含有10%胎牛血清的L-DMEM（Gibco公司）培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃飽和氣相培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合后傳代、擴(kuò)增。

1.2 材料制備

配制2%醋酸溶液后，稱(chēng)取一定質(zhì)量的殼聚糖粉末，將其完全溶于醋酸中，然后加入膠原，充分混合，再加2%醋酸至所要容量；加人少量0.25%戊二醛，將配好的混合液放入玻璃培養(yǎng)皿中，在4℃冷藏柜交聯(lián)12 h，再置于-20℃冷凍柜中，24 h冷凍成型。將成型的支架浸入堿液中和殘留的醋酸，用蒸餾水反復(fù)沖洗至中性，重新冷凍，即得殼聚糖-膠原復(fù)合支架。根據(jù)殼聚糖、膠原的不同比例分為：實(shí)驗(yàn)組1（100%膠原）、實(shí)驗(yàn)組2（殼聚糖∶膠原=3∶7）、實(shí)驗(yàn)組3（殼聚糖∶膠原=5∶5）和實(shí)驗(yàn)組4（殼聚糖∶膠原=7∶3）。將支架切成35 mm×25 mm大小，環(huán)氧乙烷消毒，DMEM培養(yǎng)液浸泡1 d后備用。

1.3 細(xì)胞-材料復(fù)合物的體外構(gòu)建

取第3代皮膚成纖維細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)，擴(kuò)增的皮膚成纖維細(xì)胞活力95%以上，制成細(xì)胞濃度為2×107cells/mL的懸液備用。將DMEM培養(yǎng)液浸泡后的4組材料，吸出多余培養(yǎng)液，用上述細(xì)胞懸液各1.5 mL均勻接種在每種材料上，4 h后加液，以后每3天換液1次，培養(yǎng)至1周。

1.4 檢測(cè)

每天以倒置相差顯微鏡觀察皮膚成纖維細(xì)胞在材料上的黏附生長(zhǎng)情況和材料降解情況。于7 d時(shí)分別取細(xì)胞-材料復(fù)合物進(jìn)行掃描電鏡觀察，方法：用PBS沖洗2次，2.5%戊二醛液固定過(guò)夜，梯度乙醇脫水，室溫下干燥。用掃描電鏡觀察材料表面形態(tài)和細(xì)胞在材料上的黏附情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

獲取的原代小兒包皮成纖維細(xì)胞為典型成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，呈長(zhǎng)梭形，胞核居中，胞質(zhì)豐富。傳代到第3代時(shí)，其細(xì)胞形態(tài)與原代細(xì)胞仍然基本保持一致（圖1）。

2.2 材料的大體觀察

制備的不同濃度配比的復(fù)合材料均為白色疏松多孔膜片，大小為35 mm×25 mm。經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后，材料均有不同程度的收縮，實(shí)驗(yàn)組1收縮最為明顯。DMEM培養(yǎng)液浸泡1 d后，各組材料形狀有所恢復(fù)，但沒(méi)有達(dá)到消毒前的規(guī)格。

細(xì)胞接種后7 d取材，各組材料均有不同程度的收縮現(xiàn)象。隨著膠原含量的增加，材料的收縮程度增大（圖2）。且隨著殼聚糖濃度的增加，材料收縮率降低，其中實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2之間、實(shí)驗(yàn)組3與實(shí)驗(yàn)組4之間無(wú)明顯差別（P＞0.05），而實(shí)驗(yàn)組3、4的收縮率較實(shí)驗(yàn)組1、2低（P＜0.05），相對(duì)能夠較好地維持原有形態(tài)。

2.3 相差顯微鏡觀察

各組材料均為三維多孔支架材料，隨著材料中膠原含量的增加，孔的連通性增加，且孔徑增加。在皮膚成纖維細(xì)胞接種后第7天，各組材料上均有細(xì)胞黏附，其中實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞形態(tài)更接近正常皮膚成纖維細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量與實(shí)驗(yàn)組1無(wú)顯著性差異（圖3）。

2.4 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，各組材料表面均有不同程度的降解現(xiàn)象，呈現(xiàn)不同的表面形態(tài)。其中實(shí)驗(yàn)組2的細(xì)胞伸展得更充分，形態(tài)更接近正常皮膚成纖維細(xì)胞（圖4）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，各組材料的收縮情況比較

圖3 細(xì)胞在材料上的黏附

圖4 掃描電鏡觀察各組細(xì)胞-材料復(fù)合物培養(yǎng)后7 d

3 討論

支架材料不僅具有連接和支持細(xì)胞的作用，而且還影響著細(xì)胞的形態(tài)、表型，控制著細(xì)胞的增殖、分化，并起到了調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的作用。理想的支架材料應(yīng)具備下列條件：①良好的組織相容性，無(wú)明顯的機(jī)體毒性和免疫原性；②多孔的立體結(jié)構(gòu)，孔隙率為70%～90%，微孔直徑20～400 μm；③性能較佳的材料微環(huán)境，有利于種子細(xì)胞增殖分化；④可控的材料降解率，保證材料的降解時(shí)間與組織形成時(shí)間相匹配；⑤一定的機(jī)械性能；⑥易于加工、消毒、儲(chǔ)存[4]。

目前用于組織工程構(gòu)建的材料主要分為可降解生物材料和不可解生物材料兩大類(lèi)。殼聚糖是一種結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分GAG十分類(lèi)似的優(yōu)良天然生物可降解材料。殼聚糖具有低毒性、良好的可吸收性和細(xì)胞相容性，易于加工成型。但也有文獻(xiàn)指出，殼聚糖的細(xì)胞親和力不夠理想，需通過(guò)表面改性或與其他材料復(fù)合來(lái)加以改善，使其更有利于細(xì)胞的黏附與增殖[5]。膠原是細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分，具有良好的細(xì)胞親和力，可以誘導(dǎo)細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)[6]。但膠原的物理強(qiáng)度差，降解速度比較快。我們將膠原與殼聚糖復(fù)合，使得殼聚糖支架上復(fù)合著大量的膠原纖維絲構(gòu)成的網(wǎng)，改善了對(duì)細(xì)胞的親和力。殼聚糖－膠原復(fù)合支架材料有著優(yōu)異的生物學(xué)性能，可用于培養(yǎng)不同的細(xì)胞，并能促進(jìn)成纖維細(xì)胞在材料表面的早期黏附[7-8]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)不同濃度配比的殼聚糖-膠原復(fù)合材料的細(xì)胞親和力進(jìn)行了初步比較。在實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合材料中殼聚糖含量過(guò)高，可使得材料的脆性增加，隨著膠原成分的降解，材料形變?cè)黾?，?dǎo)致材料出現(xiàn)斷裂或部分脫落，不利于組織的形成；復(fù)合材料中膠原含量過(guò)高，可使得材料收縮增強(qiáng)，同樣不利于組織的形成。兩者的最佳濃度配比將是我們下一步實(shí)驗(yàn)將要解決的問(wèn)題。

綜上所述，殼聚糖-膠原復(fù)合支架材料具有較好的細(xì)胞相容性，通過(guò)調(diào)節(jié)殼聚糖或膠原的含量，可調(diào)控材料的降解速率和細(xì)胞相容性。殼聚糖-膠原復(fù)合材料將成為組織工程研究中較有應(yīng)用前景的支架材料。

[1]Larger R,Vacanti JP.Tissue Engineering[J].Sci,1993,260:920-926.

[2]Senel S,lkinci G,Kas S,et al.Chitosan films and hydmgels of chlorhexidine gluconate for oral mucosal delivery[J].Int J Pharm, 2000,193(2):197-203.

[3]Park YJ,Lee YM,Park SN,et al.Platelet derived growth factor releasing chitosan sponge for periodontal bone regeneration[J]. Biomaterials,2000,21(2):153-159.

[4]楊軍,楊光輝,劉偉,等.組織工程化表皮膜片的構(gòu)建及其在增殖性疤痕治療中的應(yīng)用[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,24(4): 296-298.

[5]David S,Gruber H,Mayer BA,et al.Lumbar spinal fusion using recombinant human bone morphogenetic protein in the canine.A comparison of three dosages and two carriers[J].Spine,1999,24(19): 1973-1979.

[6]Nagai M,Hayakawa T,Fukatsu A,et al.In vitro study of collagen coating of titanium implants for initial cell attachment[J].Dent Mater J,2002,21(3):250-260.

[7]Oshima H,Nakamura M.A study on reference standard for cytotoxicity assay of biomaterials[J].Biomed Mater,1994,4(4):327-332.

[8]Isidor F,Karring T,Nyman S,et al.The significance of coronal growth of periodontal ligament tissue for new tissue for new attachment formation[J].J Clin Periodontol,1986,13:145-150.

Preliminary Study on influence of Chitosan-Collagen Compound with Different ratio for Cell Affinity

ObjectiveTo investigate the influence of chitosan-collagen compound with different ratio for cell affinity and physical variation of the scaffold.MethodsHuman dermal fibroblasts of passage 3 were cultured and amplified in vitro, then seeded on the those scaffolds in different mixed ratio groups as follows:100%collagen as group 1,70%collagen (chitosan-collagen mixed with 3∶7)as group 2,50%collagen(chitosan-collagen mixed with 5∶5)as group 3,30%collagen (chitosan-collagen mixed with 7∶3)as group 4.The attachment efficiency,attachment morphology,proliferation activity and growing morphology of human dermal fibroblasts on all scaffolds were observed by optical microscopy and scanning electronic microscope,and evaluated within 7 days cultivation.ResultsCells adhered well on those compound materials in all groups, stretched along the surface of the scaffold and grew when cultured in vitro.More importantly,the cell attachment and proliferation of the group 2 was closed to the pure collagen group 1,which could maintain the shape well with less degradation and contraction.ConclusionThe compound scaffold of group 2 with chitosan-collagen mixed with 3∶7 has a good cell compatibility and structure.Therefore,this Kind of scaffold may be successfully used for tissue engineering in future.

Chitosan;Collagen;Human dermal fibroblast;Cell affinity

R318.08

A

1673－0364（2009）04－0186－04

2009年5月23日；

2009年7月31日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.002

上海交通大學(xué)醫(yī)工（理）交叉研究基金項(xiàng)目（YG2009MS34）。

200235上海組織工程研究與開(kāi)發(fā)中心。

YANG Yang, DENG Dan,LIU Wei,YANG Yaofei.

Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.