不同培養(yǎng)基對Beagle犬骨髓基質(zhì)細胞增殖與分化的影響

黃永玲 閆福華 鐘泉 趙欣

·論著·

不同培養(yǎng)基對Beagle犬骨髓基質(zhì)細胞增殖與分化的影響

黃永玲 閆福華 鐘泉 趙欣

目的研究α-MEM、DMEM-LG、RPMI 1640三種培養(yǎng)基對Beagle犬骨髓基質(zhì)細胞（Bone marrow stromal cells，BMSCs）體外培養(yǎng)生物學行為的影響，為BMSCs的培養(yǎng)尋找合適的培養(yǎng)基。方法取6只Beagle犬的BMSCs，分別用α-MEM、DMEM-LG、RPMI 1640三種培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，比較3組細胞的貼壁、增殖及礦化等方面的差異。結(jié)果α-MEM組24 h內(nèi)貼壁的細胞數(shù)目最多；消除貼壁差異后，α-MEM和DMEM-LG促增殖作用相近；α-MEM組堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）表達量最高，但礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)目較少，DMEM-LG組礦化結(jié)節(jié)形成個數(shù)最多。結(jié)論DMEM-LG培養(yǎng)基較適合BMSCs的培養(yǎng)。

骨髓基質(zhì)細胞組織工程培養(yǎng)基增殖分化

BMSCs是成體干細胞之一，具有多向分化潛能，在不同環(huán)境和細胞因子作用下，能向骨、軟骨、肌肉和神經(jīng)等中胚層或外胚層組織細胞分化[1-2]。由于骨髓中BMSCs含量極少，建立高效快捷的體外擴增技術(shù)已成為BMSCs應用過程中迫切需要解決的問題之一。在體外培養(yǎng)擴增的研究中，培養(yǎng)基是構(gòu)成細胞體外培養(yǎng)環(huán)境的重要因素，通過改善培養(yǎng)環(huán)境，可在較短時間內(nèi)提高擴增倍數(shù)，減少擴增過程中的分化與老化[3]。目前常用的培養(yǎng)基有α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640，但不同培養(yǎng)基對種子細胞的增殖與分化作用的報道較少。本實驗通過比較這三種培養(yǎng)基對BMSCs生物學行為的影響，為牙周組織工程中種子細胞的培養(yǎng)尋找合適的培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性Beagle犬6只，體重約10 kg（購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所），圈養(yǎng)于中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院比較醫(yī)學科。

1.2 實驗試劑與主要儀器

DMEM-LG培養(yǎng)基（Gibco，美國），RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco，美國），α-MEM培養(yǎng)基（Gibco，美國），新生牛血清（Gibco，美國），胰蛋白酶（Sigma，美國），MTT（Sigma，美國），L－谷氨酰胺（Sigma，美國），ALP檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國），F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀（BD，美國），熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），酶標儀（Human，德國）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)觀察

參照文獻[4]的方法，采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs。以氯胺酮全麻，從6只Beagle犬股骨近端各抽取骨髓15 mL，在無菌條件下注入含20 mL無血清培養(yǎng)基的離心管中，1 000 rmp離心5 min（2次），棄上清液，均分成3份，置于100 mm培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)。分別加入8 mL含10%新生牛血清的α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，2 d時半量換液，5 d時全量換液。以后每隔3 d換液，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況。待細胞生長融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶+1 g/L EDTA消化傳代。

1.3.2 貼壁狀況

取傳代培養(yǎng)的第6代細胞，調(diào)整細胞密度至2.5×104cells/mL，每孔200 μL，接種到96孔板中。分別在2 h、7 h、10 h、24 h時以MTT法測定A492。

1.3.3 細胞增殖

1.3.3.1 MTT法檢測

取第4代細胞，細胞密度為1.0×104cells/mL，每孔200 μL，接種到96孔板中。采用其中一種培養(yǎng)基接種24 h后，消除貼壁差異，再分別更換不同培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。MTT法測定接種后1～7 d的A492，結(jié)果取平均值。其余兩組檢測方法同上。

1.3.3.2 集落形成

取傳代培養(yǎng)的第4代細胞，以1.0×105cells/mL接種至100 mm培養(yǎng)皿，分別用DMEM-LG、RPMI 1640、α-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，1周后行結(jié)晶紫染色，觀察集落形成情況。

1.3.3.3 細胞周期

取3種培養(yǎng)基培養(yǎng)的第3代細胞，調(diào)整密度至1.0×106cells/mL，70%乙醇固定，流式細胞儀檢測。

1.3.4 礦化能力

1.3.4.1 ALP含量測定

選取第3代細胞，以5.0×104個/孔接種于24孔板，每組6孔，每隔3 d換液，分別在接種后4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d取出。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，加入50 μL 1%TritonX-100，4℃冰箱過夜，用ALP檢測試劑盒進行測定。

1.3.4.2 Von Kosssa染色

選取第3代細胞，以5.0×104個/孔接種于24孔板，每組6孔，每隔3 d換液，連續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的白色結(jié)節(jié)，行Von Kosssa染色，在倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學處理，對ALP活性、貼壁狀況檢測結(jié)果采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)觀察

接種初始，皿底沉淀有大量血細胞，無法觀察到細胞貼壁情況。5 d時全量換液，可見大部分細胞呈梭形，少數(shù)呈圓形或多角形，α-MEM組細胞與其他兩組相比數(shù)量較多（圖1）。DMEM-LG和RPMI 1640組培養(yǎng)10～12 d可達90%融合，即可進行消化傳代。α-MEM組至7 d時應及時傳代，否則易覆層生長并形成膜狀物漂浮于培養(yǎng)基中。

2.2 貼壁狀況

隨著培養(yǎng)時間延長，細胞貼壁數(shù)逐漸增多。α-MEM組2 h時，貼壁的細胞數(shù)顯著高于其余兩組（P＜0.05），7 h時細胞已大部分貼壁，而7 h和10 h、24 h間差異無顯著性（P＞0.05）。DMEM-LG組和RPMI 1640組24 h時才大部分貼壁，此兩組間差異無顯著性（P＞0.05）（圖2）。

2.3 細胞增殖

2.3.1 MTT法檢測

消除貼壁差異后，比較3組細胞增殖情況：α-MEM組和DMEM-LG組細胞生長無顯著性差異（P＞0.05），但和RPMI 1640組間有顯著性差異(P＜0.05)（圖3）。

2.3.2 集落形成情況

結(jié)晶紫染色觀察集落形成情況，可見RPMI 1640組形成集落個數(shù)少且較細小，DMEM-LG組適中，α-MEM組形成的集落個數(shù)最多且較粗大（圖4）。

2.3.3 細胞周期

α-MEM組、DMEM-LG組、RPMI 1640組中S期細胞分別35.08%、22.70%、6.69%，G1期細胞分別為53.23%、66.08、92.03%（圖5）。

2.4 礦化能力檢測

2.4.1 ALP含量測定

不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞的ALP含量，均隨培養(yǎng)時間的延長而增加。α-MEM組ALP含量明顯高于其余兩組（P＜0.05），在第8天時含量顯著增加。DMEM-LG組從第6天開始，ALP含量逐漸高于RPMI 1640組，在第12天和第14天時差異有顯著性（P＜0.05）（圖6）。

2.4.2 Von Kosssa染色

α-MEM組增殖速度快，自身復層生長，約7 d時形成類似組織團塊樣結(jié)構(gòu)，只在培養(yǎng)皿邊緣存在少量礦化結(jié)節(jié)。DMEM-LG組約6～7 d有結(jié)節(jié)形成，RPMI 1640組約10～12 d形成結(jié)節(jié)。Von Kosssa染色可見：DMEM-LG組形成的結(jié)節(jié)數(shù)目較多且較大，散狀分布；RPMI 1640組形成的結(jié)節(jié)數(shù)目較少且較小，大多分布于培養(yǎng)皿邊緣（圖7）。

圖1 原代細胞的增殖狀況（100×）

圖2 BMSCs在三種不同培養(yǎng)基中的貼壁情況

圖3 消除貼壁差異的生長曲線（MTT法）

圖4 集落形成情況

圖5 細胞周期檢測

圖6 三種培養(yǎng)基ALP活性測定

圖7 Von Kosssa染色（100×）

3 討論

BMSCs是目前組織工程中主要的種子細胞之一，具有多向分化潛能，但其在體內(nèi)數(shù)量較少，并且BMSCs的成骨能力隨著年齡的增加而逐漸減弱[5-7]。因此，如何改善體外培養(yǎng)環(huán)境，使BMSCs能在較短時間內(nèi)迅速擴增，并減少擴增過程中的分化與老化現(xiàn)象以維持干細胞的功能，這一系列問題成為體外培養(yǎng)研究中的重點。

培養(yǎng)基是構(gòu)成細胞體外培養(yǎng)環(huán)境的重要因素，目前BMSCs體外培養(yǎng)大多采用α-MEM、DMEMLG和RPMI 1640培養(yǎng)基。α-MEM含有附加氨基酸、維生素以及核苷酸和脂肪酸等，可廣泛應用于各種類型細胞的體外培養(yǎng)。DMEM-LG是Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，營養(yǎng)成分豐富，常用于貼壁細胞培養(yǎng)。RPMI 1640培養(yǎng)基最初是針對淋巴細胞設(shè)計的，具有成分簡單、氨基酸含量較高等特點，能適用于多種細胞的培養(yǎng)[8]。

研究表明，不同培養(yǎng)基對BMSCs[3]、牙髓細胞[9]、牙周韌帶細胞[10]、骨膜細胞[11]的增殖、分化作用是不同的。但哪種是BMSCs體外培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，各學者所得出的結(jié)論不盡相同。Javazon等[12]培養(yǎng)鼠BMSCs發(fā)現(xiàn)，α-MEM中的細胞擴增倍數(shù)是DMEM的2倍。Majumdar等[13]研究表明，α-MEM較DMEM-LG更能促進人BMSCs的增殖。然而，Coelho等[14]發(fā)現(xiàn)，α-MEM和DMEM-LG對人BMSCs增殖沒有顯著差異，但α-MEM有助于人BMSCs成骨能力的維持。本實驗通過比較α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640三種培養(yǎng)基對BMSCs貼壁、增殖和分化方面的影響，為BMSCs的培養(yǎng)尋找合適的培養(yǎng)基。

貼壁是體外培養(yǎng)BMSCs的主要過程之一，是BMSCs生長的必要條件。本實驗發(fā)現(xiàn)，α-MEM組24 h貼壁的細胞數(shù)明顯高于DMEM-LG組和RPMI 1640組，此結(jié)果和須玨華等[3]的研究結(jié)論一致。研究表明，影響細胞貼壁的主要因素有：血清[15]、貼壁介質(zhì)表面特性[16]和pH值[17]等。本實驗通過比較三種培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)三者之間pH值相差約0.3～0.4。動物細胞大多數(shù)需要在輕微的堿性條件下生長，α-MEM與其余兩種相比呈偏堿性，因而我們推斷三種培養(yǎng)基中不同的pH值影響了BMSCs的貼附。

本研究發(fā)現(xiàn)在消除貼壁差異后，α-MEM和DMEM-LG促增殖作用相近，α-MEM略高于DMEM-LG；RPMI 1640促增殖作用明顯不如α-MEM和DMEM-LG。有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中的多種成分能影響細胞的增殖。Lopez等[10]和Maeno等[18]的研究表明，增加一定量的鈣濃度可促進成骨細胞增殖。比較三組鈣濃度：α-MEM為200 mg/L，DMEMLG為265 mg/L，RPMI 1640無氯化鈣成分[9]。此外，有研究表明，糖濃度也是影響細胞增殖的要素之一。比較三種培養(yǎng)基成分發(fā)現(xiàn)，RPMI 1640中葡萄糖含量是α-MEM和DMEM-LG的2倍。Stolzing等[19]發(fā)現(xiàn)，較低的葡萄糖濃度能減少細胞凋亡，促進細胞增殖。Tennant等[20]認為，高濃度葡萄糖代謝產(chǎn)生較多乳酸，可抑制細胞生長。因此，我們推測培養(yǎng)基中鈣和糖濃度均可能影響細胞的增殖，究竟哪種成分作用更強，尚有待進一步的研究。

BMSCs在三種培養(yǎng)基中，均可向成骨方向誘導。本實驗結(jié)果表明，α-MEM組中ALP含量明顯高于其余2組，但礦化結(jié)節(jié)形成的個數(shù)最少；DMEMLG組ALP含量低于α-MEM組，但形成的礦化結(jié)節(jié)個數(shù)最多。Maeno等[18]報道，ALP陽性細胞率與鈣濃度的增加成正相關(guān)。Lopez等[10]也報道ALP表達與培養(yǎng)基中鈣濃度的相對增加有關(guān)。本實驗單從ALP檢測結(jié)果上看與其相符，但Von Kosssa染色結(jié)果卻與其不一致。Goshima等[21]的研究表明，細胞數(shù)量過多，容易造成細胞堆積，不利于細胞伸展和成骨潛能的發(fā)揮。因而我們推測造成此結(jié)果的原因可能是α-MEM組中細胞貼壁率高且增殖速度快，造成細胞基數(shù)大，相應分泌的ALP也比較高，但其成骨潛能方面受到了抑制。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基α-MEM促進BMSCs的增殖，但礦化能力方面較弱；DMEM-LG培養(yǎng)基促進細胞增殖和分化，較適合BMSCs的體外培養(yǎng)。

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Effects of Media on the Proliferation and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells in Beagle Dogs

ObjectiveTo investigate the effects of different media:α-MEM,DMEM-LG and RPMI 1640 on the biological behavior of bone marrow stromal cells(BMSCs)in Beagle dogs,and provide the more ideal culture medium for BMSCs.MethodsBMSCs derived from 6 Beagle dogs were harvested and grown in α-MEM,DMEM-LG and RPMI 1640 media respectively.The proliferation,attachment rate and mineralized nodules of the cells were observed and compared.ResultsCells cultured by α-MEM showed the highest attachment rat.After eliminating the difference of adherent rate,there was no obvious difference in the proliferation between α-MEM and DMEM.In α-MEM group,the expression of alkaline phosphate (ALP)was the highest,while the number of mineralized nodules was the least.DMEM group exhibited the most mineralized nodules.ConclusionAs a culture medium DMEM-LG may be more suitable for BMSCs of dogs in vitro.

Bone marrow stromal cells;Tissue engineering;Media;Proliferation;Differentiation

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）04－0181－05

2009年5月27日；

2009年7月1日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.08.001

國家自然科學基金(30471892)、福建省自然科學基金（2008J0085）、福建醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院重點學科建設(shè)學術(shù)發(fā)展基金[閩醫(yī)大口腔（2008）39號]。

350004福建省福州市福建醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，福建醫(yī)科大學口腔組織工程研究室。

閆福華。

HUANG Yongling,YAN Fuhua,ZHONG Quan,ZHAO Xin.

School of Stomatology,Tissue Engineering Research Center of Stomatology, Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China.Corresponding author:YAN Fuhua.