大白菜ＰＨＫ４基因ｃＤＮＡ３′端序列的克隆及分析

任相亮　梁　丹　李　丹等

摘要采用3′RACEcDNA末端擴(kuò)增技術(shù)，克隆出大白菜PHK4基因3′端cDNA序列。該序列長810bp，其中編碼區(qū)序列546bp，編碼181個(gè)氨基酸，其編碼序列、氨基酸序列與擬南芥AHK4基因的同源性分別為90%和96%，說明PHK4基因與AHK4基因編碼區(qū)的同源性較高，而PHK4基因3′UTR區(qū)與AHK4基因3′UTR區(qū)的同源性為52%，遠(yuǎn)低于編碼區(qū)。

關(guān)鍵詞大白菜；PHK4基因；3′RACE；克隆

中圖分類號(hào)Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-5739（2009）01-0007-02

植物在生長發(fā)育過程中有多種復(fù)雜的信號(hào)系統(tǒng)來識(shí)別并應(yīng)答外界環(huán)境刺激，蛋白磷酸化和去磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要的機(jī)制，這一過程由蛋白激酶催化。根據(jù)磷酸化依賴底物的特異性不同，可將蛋白激酶分為：絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶和組氨酸激酶[1，2]。典型的雙組分信號(hào)系統(tǒng)是由組氨酸蛋白激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白組成，當(dāng)組氨酸激酶以某種方式感應(yīng)到環(huán)境刺激后，其組氨酸殘基自身磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的天冬氨酸殘基上，進(jìn)而引起下游的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境變化[3，4]。

細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過雙組分信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行的。在擬南芥中，該信號(hào)系統(tǒng)由感受細(xì)胞分裂素的雜合型組氨酸激酶型受體、磷酸轉(zhuǎn)移蛋白和應(yīng)答調(diào)控蛋白組成[4]。目前已確認(rèn)的擬南芥中的細(xì)胞分裂素受體有3個(gè)：AHK2、AHK3和AHK4，其中AHK4主要在根中表達(dá)，該基因突變后，植株會(huì)失去細(xì)胞分裂素對(duì)根伸長的抑制作用[5，6]，從而影響植物的正常生長。

大白菜因其營養(yǎng)豐富、種植簡便、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，成為廣泛栽培且受人們喜愛的蔬菜之一。為了研究大白菜中細(xì)胞分裂素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特點(diǎn)，筆者擬首先擴(kuò)增出大白菜中與AHK4基因同源的細(xì)胞分裂素受體基因PHK4 （Pekinensis Histidine Kinase 4）的cDNA序列。RACE技術(shù)即快速cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE），它利用PCR技術(shù)，由已知的cDNA序列擴(kuò)增出完整、真實(shí)的cDNA5′和3′末端序列，該方法也被稱為錨定PCR或單邊PCR[7]。目前，RACE技術(shù)正逐步取代經(jīng)典的cDNA文庫篩選技術(shù)，已成為獲得全長cDNA序列的一種重要手段[8]。本研究以本課題組從大白菜中克隆得到的一段PHK4基因的cDNA序列為基礎(chǔ)，利用3′RACE技術(shù)對(duì)該基因3′端未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了大白菜PHK4基因的3′端真實(shí)序列，從而為進(jìn)一步研究該基因的功能和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1材料。大白菜AB-81。

1.1.2試劑。Trizol試劑購自上海英駿生物技術(shù)有限公司；dNTP Mixture，PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，RNArase Inhibitor，瓊脂糖凝膠回收試劑盒，pMD19-T載體均購自TaKaRa公司。

1.1.3引物設(shè)計(jì)。參照AMBION公司的RACE試劑盒說明書，合成3′RACE Adaptor. Adaptor1和Adaptor2（見表1）；根據(jù)大白菜一段PHK4基因的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物SP1和SP2，所有引物均在上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA的提取。利用Trizol試劑一步法提取大白菜總RNA[9]。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在200μLPCR管中加入大白菜RNA 6μL（50ng），3′RACE Adaptor 2μL（20μM），dNTP Mixture（10mM）1μL，加RNase Free H2O至10μL，混勻后70℃保溫15min，迅速在冰上冷卻2min；加5×Prime ScriptTM Buffer 4μL、RNArase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Prime ScriptTM Reverse Tran scriptase（200U/μL）0.5μL，加RNase Free H2O至20μL，混勻后42℃保溫1h；70℃處理15min，冰上冷卻，得到大白菜cDNA。

1.2.33′RACE擴(kuò)增。按照AMBION RACE cDNA Ampli-fica tion Kit說明書操作步驟進(jìn)行。先以Adaptor1和SP1為引物，進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)；再以Adaptor2和SP2為引物，進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)。

1.2.4PCR產(chǎn)物回收和測序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，連接到pMD19-T載體上，提交上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.5分析方法。用NCBI和MEGA軟件對(duì)核酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，RNAdraw生物學(xué)軟件分析預(yù)測3′UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)[10-12]。

2結(jié)果與分析

2.13′ACE擴(kuò)增

用Trizol法提取大白菜總RNA，電泳結(jié)果如圖1所示。以大白菜的cDNA為模板，Adaptor1和SP1為引物，進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng)；以第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，Adaptor2和SP2為引物，進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)（如圖2），在800bp左右有1條特異性的條帶。將目的片段回收后，連接到pMD19-T載體上進(jìn)行序列測定。

2.2大白菜PHK43′端編碼序列分析

將得到的序列去掉3′RACE Adaptor后，得到810bp的片段，用NCBI預(yù)測該序列的編碼區(qū)為546bp，編碼181個(gè)氨基酸。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)樹表明（如圖3），與擬南芥AHK4基因的同源性最高，編碼區(qū)序列的同源性為90%，氨基酸序列的同源性為96%。由結(jié)果表明，可確定所得到的序列是PHK4基因的3′端序列。

2.3大白菜PHK4基因與擬南芥AHK4基因3′UTR區(qū)比較

將得到的大白菜PHK4基因的3′UTR區(qū)序列與擬南芥AHK4基因的3′UTR區(qū)序列比對(duì)，此二者的同源性僅為52%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于編碼區(qū)核酸序列的同源性。大白菜PHK4基因和擬南芥AHK4基因3′UTR區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（如圖4）的預(yù)測圖看出，二者雖然有相似的地方，但大白菜3′UTR區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯少于擬南芥，這可能會(huì)影響mRNA的穩(wěn)定性，從而在所屬植物中實(shí)施不同的調(diào)控策略[11]。

3結(jié)論與討論

在大多數(shù)情況下，一個(gè)新基因全長cDNA序列的獲得一般通過篩選cDNA文庫或RACE法。本研究利用實(shí)驗(yàn)室已得到的大白菜PHK4基因的一段cDNA編碼序列設(shè)計(jì)引物，利用3′RACE方法克隆出大白菜PHK4基因cDNA3′末端序列。分析表明，該基因與擬南芥AHK4基因的核酸序列的同源性為90%，氨基酸序列的同源性為96%。因此，可利用這種同源性，參考擬南芥基因的序列信息設(shè)計(jì)引物，克隆出大白菜PHK4基因的片段，再結(jié)合RACE技術(shù)得到基因的全長序列。

3′UTR對(duì)mRNA表達(dá)的調(diào)控作用極其重要，它不僅能調(diào)控mRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性及降解速率，控制其利用效率，協(xié)助辨認(rèn)特殊密碼子，而且還決定mRNA的翻譯位點(diǎn)及控制其翻譯效率[13]。從大白菜PHK4基因的3′UTR區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯少于擬南芥，而莖環(huán)結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)，這會(huì)抑制特殊蛋白質(zhì)的結(jié)合，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄后積累及翻譯位點(diǎn)的識(shí)別[14]。本研究利用3′RACE技術(shù)，擴(kuò)增出大白菜PHK4基因的3′端序列，為以后研究該基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系打下基礎(chǔ)。

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