柑橘二倍體胞質(zhì)雜種與無核育種

蔡小東(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070)

郭文武 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

柑橘二倍體胞質(zhì)雜種與無核育種

蔡小東(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州434025；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070)

郭文武 (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

綜述了柑橘二倍體胞質(zhì)雜種的產(chǎn)生方式、對稱融合中胞質(zhì)雜種產(chǎn)生的可能機(jī)理以及柑橘二倍體胞質(zhì)雜種的早期篩選，探討了柑橘二倍體胞質(zhì)雜種在無核育種中的應(yīng)用前景。

柑橘(Citrus)；胞質(zhì)雜種；對稱融合；綠色熒光蛋白；胞質(zhì)雄性不育

柑橘(Citrus)是世界和我國南方第一大水果。原生質(zhì)融合技術(shù)能有效克服柑橘有性雜交不親和、雌/雄性敗育、多胚性干擾及花期不遇等常規(guī)育種中遇到的問題，可實(shí)現(xiàn)核DNA和胞質(zhì)基因重組，轉(zhuǎn)移有利的農(nóng)藝性狀，創(chuàng)造新的種質(zhì)或優(yōu)良的品種；特別是對于遺傳上高度雜合、多基因控制的數(shù)量性狀遺傳及分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)薄弱的柑橘，原生質(zhì)體融合是實(shí)現(xiàn)全部或部分基因組轉(zhuǎn)移的有效途徑，為柑橘遺傳改良帶來了廣闊的前景。迄今，柑橘原生質(zhì)融合已取得重大進(jìn)展，全世界已獲得大量柑橘體細(xì)胞雜種/胞質(zhì)雜種，這些新種質(zhì)在柑橘砧木育種[1,2]、接穗品種培育[1,3,4]及作為三倍體無核育種親本之一[1,5]等方面表現(xiàn)出很大的潛力。柑橘二倍體胞質(zhì)雜種只含有親本之一的核基因組和另一親本的細(xì)胞質(zhì)基因組，而倍性水平?jīng)]有增加，但胞質(zhì)基因組發(fā)生了重組。因此，在轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組控制的有益農(nóng)藝性狀到一個(gè)新的遺傳背景方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。為此，筆者就近年來柑橘對稱融合產(chǎn)生二倍體胞質(zhì)雜種的研究進(jìn)行綜述。

1 胞質(zhì)雜種的產(chǎn)生方式

柑橘對稱融合后再生體細(xì)胞雜種的倍性一般為四倍體，但也有部分為二倍體，也有一些三倍體雜種再生的報(bào)道[1,6]。此外，極少數(shù)組合還再生五倍體、六倍體雜種[7]。原生質(zhì)體融合理論上可以形成48種不同類型的體細(xì)胞雜種[8]，這些雜種又可分為對稱雜種、非對稱雜種和胞質(zhì)雜種。一般來說，可以采取供-受體融合、胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合以及對稱融合3種融合方法創(chuàng)造胞質(zhì)雜種。但前2種融合操作程序極為繁瑣，且再生完整植株比較困難。如Xu等[9]運(yùn)用胞質(zhì)體-原生質(zhì)體融合方式獲得了雜種細(xì)胞系，但它們很難再生完整植株。實(shí)際上，柑橘對稱融合產(chǎn)生胞質(zhì)雜種比較普遍，目前已有多例二倍體葉肉親本型胞質(zhì)雜種植株再生的報(bào)道[1,3,4,10]。

2 對稱融合中胞質(zhì)雜種產(chǎn)生的可能機(jī)理

目前，對稱融合中胞質(zhì)雜種產(chǎn)生的機(jī)理還未闡明，根據(jù)研究結(jié)果，前人提出了一些可能機(jī)理和假說[1,8,11]，主要包括：(1)雙親細(xì)胞融合過程中，胞質(zhì)融合并發(fā)生細(xì)胞器混合，雙親細(xì)胞核雖共存于一個(gè)雜種細(xì)胞，但未融合，在隨后雜種細(xì)胞發(fā)育過程中，雙親細(xì)胞核發(fā)生分離，產(chǎn)生胞質(zhì)雜種[8]；(2)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都融合在一起，但由于雙親遺傳上不協(xié)調(diào)或細(xì)胞分裂周期不同步，雜種細(xì)胞在發(fā)育過程中排除掉親本之一的染色體。如在遠(yuǎn)緣體細(xì)胞雜交中，常發(fā)生這種現(xiàn)象[1]；(3)來自破裂愈傷組織原生質(zhì)體的線粒體DNA整合到葉肉原生質(zhì)體中。電刺激能夠提高原生質(zhì)體的分裂頻率和植板率，且原生質(zhì)體易破碎，Rech等[11]認(rèn)為破裂原生質(zhì)體釋放的胞質(zhì)成分有可能整合進(jìn)受體細(xì)胞, 從而導(dǎo)致胞質(zhì)雜種的產(chǎn)生。這些假說尚缺乏直接的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)，且沒有考慮分化再生過程中胞質(zhì)遺傳組成的動態(tài)變化。

研究表明，柑橘對稱融合產(chǎn)生二倍體胞質(zhì)雜種受葉肉親本的基因型、兩親本親緣關(guān)系遠(yuǎn)近、融合方式及兩親本細(xì)胞分裂的非同步性等因素影響[3,12～14]。一般來說，種間融合時(shí)雙親親緣關(guān)系越近，采用電融合、以高比率的葉肉原生質(zhì)體/愈傷組織原生質(zhì)體及選擇胚胎發(fā)生能力強(qiáng)的胚性愈傷組織作為懸浮系親本，越易得到胞質(zhì)雜種。Moriguchi等[12]認(rèn)為特殊的懸浮細(xì)胞系或親本組合，能提高胞質(zhì)雜種再生頻率。例如，Tokunaga等[13]以‘Juman’溫州蜜柑作為懸浮系親本，與檸檬和香橙融合時(shí)都獲得了胞質(zhì)雜種，但Hidaka等[14]以‘Saruwatari’溫州蜜柑作為懸浮系親本分別與粗檸檬和香橙融合時(shí)，只得到體細(xì)胞雜種。Moriguchi等[12]還發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體培養(yǎng)基中糖分的組成對體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的形成具有選擇性作用。深入研究柑橘類植物原生質(zhì)體對稱融合普遍形成二倍體胞質(zhì)雜種的規(guī)律、二倍體胞質(zhì)雜種的早期篩選以及雜種細(xì)胞的再生優(yōu)勢等基礎(chǔ)問題，可以為通過細(xì)胞融合途徑有針對性地創(chuàng)造二倍體胞質(zhì)雜種及轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)性狀等研究提供理論依據(jù)。

3 柑橘二倍體胞質(zhì)雜種的早期篩選

原生質(zhì)體融合后的早期培養(yǎng)體系中，除了異核體外，還包括大量未融合的親本類型原生質(zhì)體、同核體以及其它的核-質(zhì)組合。對稱融合產(chǎn)生二倍體胞質(zhì)雜種的機(jī)理至今仍處于推測階段，研究者在設(shè)計(jì)融合組合時(shí)不能確定融合后再生產(chǎn)物的倍性。在以創(chuàng)造二倍體胞質(zhì)雜種為主要目標(biāo)的研究過程中，從大量再生的愈傷組織、胚狀體或植株中對二倍體胞質(zhì)雜種進(jìn)行有效的早期篩選，有利于避免許多盲目的鑒定工作，節(jié)省人力和物力。近年來，綠色熒光蛋白( GFP)作為一個(gè)新的篩選標(biāo)記，在柑橘體細(xì)胞融合中得到了成功的應(yīng)用[15～17]。在“愈傷組織原生質(zhì)體 + 轉(zhuǎn)GFP基因葉肉原生質(zhì)體”的融合模式下，由于柑橘葉肉原生質(zhì)體不能分裂，愈傷組織原生質(zhì)體再生類型沒有GFP熒光，因此只有再生雜種才能發(fā)出GFP熒光，這為細(xì)胞融合創(chuàng)造柑橘新種質(zhì)提供了新的篩選方法，也為研究細(xì)胞融合中的雜種優(yōu)勢現(xiàn)象提供了極好的材料。Guo等[15]發(fā)現(xiàn)二倍體胞質(zhì)雜種胚狀體與四倍體體細(xì)胞雜種胚狀體熒光強(qiáng)弱不同，根據(jù)GFP熒光強(qiáng)弱，可以了解柑橘二倍體胞質(zhì)雜種在何階段產(chǎn)生并且能夠進(jìn)行早期篩選，為研究二倍體胞質(zhì)雜種的可能形成機(jī)理提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系。Cai等[17]提出“二倍體轉(zhuǎn)GFP基因胚性愈傷組織原生質(zhì)體 + 二倍體葉肉原生質(zhì)體”新的融合模式，認(rèn)為在該模式下，早期篩選胞質(zhì)雜種變得更直觀(根據(jù)GFP熒光表達(dá)的有無進(jìn)行判斷)。由于通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得愈傷組織比獲得植株更快更方便，因此該模式下轉(zhuǎn)GFP基因柑橘材料來源更廣泛，并且通過這種融合模式獲得的胞質(zhì)雜種沒有GFP標(biāo)記污染和安全性問題，獲得的胞質(zhì)雜種具有商業(yè)應(yīng)用潛力。

4 柑橘二倍體胞質(zhì)雜種的應(yīng)用前景

線粒體和葉綠體是2類都含有自主DNA的細(xì)胞器，它們共同組成了細(xì)胞的核外遺傳系統(tǒng)，像核基因組一樣，它們也控制著植物許多重要的農(nóng)藝性狀，目前所知的植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育[8]和抗寡霉素性狀受線粒體基因組控制，而對抗生素的抗性由葉綠體基因編碼。植物有性雜交中，由于胞質(zhì)基因組一般具有母性遺傳的特點(diǎn)，大多數(shù)情況下得到的后代往往只具有母本的胞質(zhì)基因組。相對而言，原生質(zhì)體融合技術(shù)能創(chuàng)造大量新的胞質(zhì)基因組和新的核-質(zhì)互作模式，在通過轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組控制的優(yōu)良農(nóng)藝性狀培育有潛在價(jià)值的植物資源方面具有極大的優(yōu)勢。此外，原生質(zhì)體融合技術(shù)相對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)而言，創(chuàng)造的體細(xì)胞雜種或胞質(zhì)雜種不存在生物安全方面的問題，可以更快地得到應(yīng)用。

柑橘對稱融合一般采用“胚性懸浮系原生質(zhì)體 + 葉肉原生質(zhì)體”的融合模式，在這種模式下，可以再生葉肉親本型胞質(zhì)雜種。對這些二倍體胞質(zhì)雜種進(jìn)行核基因組和線粒體基因組分析，發(fā)現(xiàn)它們總是只擁有葉肉親本的核基因組、懸浮系親本的線粒體基因組和任一親本的葉綠體基因組[1]。因此，利用溫州蜜柑具有CMS的特性[18]，通過細(xì)胞融合技術(shù)可以將該類型的CMS胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到果實(shí)有籽或多籽柑橘品種中，使受體品種獲得CMS性狀，有望培育出既不改變受體品種品質(zhì)又無籽的柑橘新品種。如Guo等[3]將具有胞質(zhì)雄性不育特性的‘國慶1號’溫州蜜柑作為胚性懸浮系親本，以多籽柑橘品種作為葉肉原生質(zhì)體親本，對稱融合獲得了‘國慶1號’溫州蜜柑與雜種柚、寬皮橘、橘橙有籽柑橘品種的二倍體葉肉親本型胞質(zhì)雜種植株，1年內(nèi)實(shí)現(xiàn)了溫州蜜柑CMS性狀向其它多籽柑橘類型的有效轉(zhuǎn)移。最近，其中一個(gè)組合已開花結(jié)果，果實(shí)表現(xiàn)無籽性狀。同樣以‘國慶1號’溫州蜜柑作為胚性懸浮系親本，采用對稱融合方法，Cai等[4]在約8個(gè)月的時(shí)間內(nèi)成功將‘國慶1號’溫州蜜柑線粒體DNA轉(zhuǎn)移到沙田柚和冰糖橙中。因此，通過對稱融合方式，創(chuàng)造轉(zhuǎn)移了CMS性狀的二倍體胞質(zhì)雜種，有望成為柑橘無核育種的新思路。

[1]Grosser J W,Ollitrault P,Olivares-Fuster O.Somatic hybridization inCitrus:An effective tool to facilitate variety improvement[J].InVitroCell Dev Biol-Plant,2000,36:434～449.

[2]Vardi A,Levin I,Carmi N.Induction of seedlessnss inCitrus:from classical techniques to emerging biotechnological approaches [J].J Amer Soc Hort Sci,2008,133:117～126.

[3]Guo W W,Prasad D,Cheng Y J,etal.Targeted cybridization inCitrus:transfer of Satsuma cytoplasm to seedy cultivars for potential seedlessness[J].Plant Cell Rep,2004,22:752～758.

[4]Cai X D,Fu J,Deng X X,etal.Production and molecular characterization of potential seedless cybrid plants between pollen sterile Satsuma mandarin and two seedyCitruscultivars[J].Plant Cell Tiss Org Cult,2007,90:275～283.

[5]Viloria Z,Grosser J W,Bracho B.Immature embryo and seedling development of acid citrus fruit derived from interploid hybridization[J].Plant Cell Tiss Org Cult,2005,82:159～167.

[6]Kunitakei H,Nagasawa K,Takami K,etal.Molecular and cytogenetic characterization of triploid somatic hybrids between ‘Shogun’ Mandarin and Grapefruit[J].Plant Biotechnology,2002,19:345～352.

[7]Guo W W,Deng X X.Intertribal hexaploid somatic hybrid plant regeneration from electrofusion between diploids ofCitrussinensisand its sexually incompatible relative,Clausenalansium[J].Theor Appl Genet,1999,98:581～585.

[8]Kumar A,Cocking E C.Protoplast fusion:a novel approach to organelle genetics in higher plants[J].Amer J Bot,1987,74:1289～1303.

[9]Xu X Y,Liu J H,Deng X X.Isolation of cytoplasts from Satsuma mandarin (CitrusunshiuMarc.) and production of alloplasmic hybrid calluses via cytoplast-protoplast fusion[J].Plant Cell Rep,2006,25:533～539.

[10]Grosser J W,Gmitter F G.Jr Tusa N,etal.Further evidence of a cybridization requirement for plant regeneration from citrus leaf protoplasts[J].Plant Cell Rep,1996,15:672～676.

[11]Rech E L,Ochatt S J,Chand P K,etal.Electro-enhancement of division of plant protoplast-derived cells[J].Protoplasma,1987,141:169～176.

[12]Moriguchi T,Hidaka T,Omura M,etal.Genotype and parental combination influence efficiency of cybrid induction inCitrusby electrofusion[J].HortSci,1996,31:275～278.

[13]Tokunaga T,Yamao M,Takenak M,etal.Cybrid plants produced by electrofusion between Satsuma mandarin (Citrusunshiu) and YuZu (C.junos) or Lemon (C.limon),and recombination of mitochondrial genomes[J].Plant Biotechnology,1999,16:297～301.

[14]Hidaka T,Omura M.Regeneration of somatic hybrid plants obtained by electrical fusion between Satsuma mandarin (Citrusunshiu) and rough lemon (C.jambhiri) or Yuzu (C.junos)[J].Japan J Breed,1992,42:79～89.

[15]Guo W W,Grosser J W.Somatic hybrid vigor inCitrus:direct evidence from protoplast fusion of an embryogenic callus line with a transgenic mesophyll parent expressing the GFP gene[J].Plant Sci,2005,168:1541～1545.

[16]Olivares-Fuster O,Pena L,Duran-Vila N,etal.Green fluorescent protein as a visual marker in somatic hybridization[J].Annals of Botany,2002,89:491～497.

[17]Cai X D,Liu X,Guo W W.GFP expression as an indicator of somatic hybrids between transgenic Satsuma mandarin and calamondin at embryoid stage[J].Plant Cell Tiss Org Cult,2006,87:245～253.

[18]Yamamoto M,Matsumoto R,Okudai N,etal.Aborted anthers of Citrus result from gene-cytoplasmic male sterility[J].Sci Hort,1997,70:9～14.

S603.6

A

1673-1409(2009)02-S025-03

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.008

2009-03-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771481)；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20060504014)

蔡小東，(1978-)，男，湖北浠水人，農(nóng)學(xué)博士，講師，主要從事園藝植物生物技術(shù)育種研究.

郭文武，Email：guoww@mail.hzau.edu.cn.