抑制T細胞增殖的抗CD98重鏈單克隆抗體的建立

練高建，吳端生，蘇澤紅，安友康二

(1.南華大學實驗動物學部，湖南 衡陽 421001;2.南華大學藥學與生命科學學院，湖南 衡陽 421001;3.日本德島大學大學院免疫學教研室，日本 德島 770－8503)

CD98，又稱為4F2抗原或 FRP－1，是一組與免疫應(yīng)答有關(guān)的、位于白細胞表面的約200種蛋白質(zhì)的其中一種，它們的遷移、與細胞間的相互作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能激活 T細胞。Haynes等［1］的研究發(fā)現(xiàn)，CD98是淋巴細胞表面抗原的一種，在所有已建立的人體組織培養(yǎng)細胞及大部分的人體惡性腫瘤細胞中均有表達［2，3］。研究表明，CD98(4F2)在諸如細胞粘附、融合及氨基酸轉(zhuǎn)運等過程中發(fā)揮重要作用。CD98(4F2)由一條 CD98重鏈(CD98 heavy chain，CD98hc，又稱4F2hc)—Slc3a2的基因產(chǎn)物和一條輕鏈(CD98 light chain，CD98lc，又稱 4F2lc)組成。30年前Haynes等［4］首次發(fā)現(xiàn) CD98hc是 T細胞激活的一種標志。隨后 Hemler等［2］證明，CD98與細胞的增殖及存活有關(guān)，且發(fā)現(xiàn)CD98高表達于增殖的組織表面。CD98具有兩種不同的功能:介導(dǎo)整合素信號通路及氨基酸轉(zhuǎn)運［5，6］;CD98hc的不同區(qū)域?qū)@些功能發(fā)揮不同作用。但是，CD98hc對T細胞功能究竟有何種影響，目前仍不清楚。

為了尋找能調(diào)節(jié)T細胞功能的分子，我們制作了大量能識別小鼠脾細胞并且具備調(diào)節(jié)T細胞功能的單克隆抗體。其中一株雜交瘤細胞系分泌的抗體具有最強的抑制CD4+和CD8+T細胞增殖的能力，經(jīng)過鑒定，發(fā)現(xiàn)其目標分子為 CD98hc。這是首次發(fā)現(xiàn)CD98hc在T細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，因此，有必要進一步研究，對CD98進行修飾是否能治療一些與T細胞異常增殖誘導(dǎo)的相關(guān)疾病。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞系

BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠和 Wistar大鼠，均為雌性，購自日本SLC公司，飼養(yǎng)于德島大學屏障環(huán)境設(shè)施內(nèi)。SP2/0骨髓瘤細胞系，NIH3T3細胞系，均購自日本Riken細胞庫。

1.2 試劑

聚乙二醇(PEG1500)，完全及不完全 RPMI－1640培養(yǎng)液，HAT培養(yǎng)液，均購自Sigma公司。NBS培養(yǎng)液，Rat IgG抗體，蛋白G瓊脂糖，銀染試劑盒，［3H］－亮氨酸，均購自購自Invitrogen公司。

1.3 免疫程序及融合

收集BALB/c小鼠脾細胞約2×107個，每隔10 d腹腔注射免疫Wistar大鼠，共3次，在第三次免疫后5 d，處死大鼠，收集Wistar大鼠脾細胞，與SP2/0在添加PEG1500的情況下進行融合，然后將融合后的細胞在含有 HAT的 RPMI－1640培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，約14 d后，對所有的雜交瘤細胞進行篩選，識別T細胞的則確定為陽性克隆。選擇陽性克隆進行下一步研究。

1.4 混合淋巴細胞反應(yīng)實驗

分別取 C57BL/6和 BALB/c小鼠脾臟制備細胞懸液。其中 BALB/c小鼠脾細胞懸液(2×107/mL)在37℃下，加絲裂霉素 C(50 μg/mL)處理 30 min，培養(yǎng)液洗滌3次后用5%NBS培養(yǎng)液配制細胞懸液(5×106/mL)，作為刺激細胞，加入96孔培養(yǎng)板，每孔5×105/0.1 mL;再加入 C57BL/6脾細胞懸液，為反應(yīng)細胞，也是每孔5×105/0.1 mL;再分別加入雜交瘤細胞上清及對照Rat IgG抗體。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，對細胞進行計數(shù)。

1.5 免疫共沉淀實驗

從BALB/c小鼠收集脾細胞，加入裂解緩沖液作用約15 min，然后離心收集上清，再加入 I－142于4℃共培養(yǎng)約2 h。然后再與蛋白 G瓊脂糖共培養(yǎng)約1 h。用裂解緩沖液洗3遍，然后往上述反應(yīng)物中加入樣品緩沖液后，于95℃反應(yīng)3 min，進行凝膠電泳，電泳后的凝膠用銀染試劑盒銀染。

1.6 細胞分布實驗

配制1 mg/mL的纖連蛋白溶液用于包被96孔板，于4℃培養(yǎng)過夜。NIH3T3細胞及I－142于4℃共培養(yǎng)約20 min，然后將上述培養(yǎng)物加至纖連蛋白包被的96孔板中培養(yǎng)約12 h，每組在顯微鏡下觀察約300個細胞，通過計算細胞擴展的百分比來測量細胞的分布。

1.7 氨基酸轉(zhuǎn)運實驗

NIH3T3細胞(購自日本 Riken細胞庫)與［3H］－亮氨酸共培養(yǎng)約 12 h，然后用液閃法檢測［3H］－亮氨酸的摻入率。

2 結(jié)果

2.1 抑制T細胞增殖的單克隆抗體的建立

從BALB/c小鼠收集脾細胞免疫Wistar大鼠，得到大量能夠識別小鼠脾細胞的雜交瘤細胞系。然后通過混合淋巴細胞反應(yīng)實驗篩選出43株能夠促進或抑制T細胞增殖的雜交瘤細胞系。其中一株雜交瘤細胞系所分泌的單克隆抗體對T細胞增殖具有最強的抑制效果(圖 1)，我們將其命名為 I－142，并對其進行進一步的研究。

2.2 單克隆抗體識別的目標分子

將從BALB/c小鼠收集的全脾細胞的裂解液與I－142單克隆抗體進行免疫共沉淀反應(yīng)，然后將其轉(zhuǎn)移到凝膠上進行電泳。電泳后的凝膠進行銀染，結(jié)果顯示，目標帶位于約75×103(圖2)［7］。對切割后的目標帶進行液相色譜分析，表明 I－142單克隆抗體識別的目標分子是CD98重鏈。

圖 1 I－142 抑制 CD4+和 CD8+T 細胞的增殖(＊＊P ＜0.01)Fig.1 The antibody I－142 suppresses the proliferation of CD4+and CD8+T cells. ＊＊P ＜ 0.01

圖2 I－142識別CD98重鏈(目標帶位于約75×103處)(C:對照IgG抗體)Fig.2 The antibody I－142 recognizes CD98hc(molecular weight is about 75×103).C:control IgG antibody

2.3 I-142阻止纖連蛋白介導(dǎo)的細胞分布但不影響氨基酸轉(zhuǎn)運

研究表明CD98hc與整合素信號通路有關(guān)聯(lián)［11］。為證實I－142是否具有調(diào)節(jié)整合素信號通路的功能，我們檢測了 I－142對纖連蛋白介導(dǎo)的細胞分布的影響。結(jié)果顯示，I－142可以抑制纖連蛋白介導(dǎo)的細胞分布(圖3A)，表明I－142具有調(diào)節(jié)整合素介導(dǎo)的細胞分布的功能。

CD98hc與CD98輕鏈形成聚合體，從而控制氨基酸的轉(zhuǎn)運。我們通過添加I－142單克隆抗體來培養(yǎng)NIH3T3細胞，并檢測［3H］－亮氨酸的摻入率。但結(jié)果表明，I－142單克隆抗體未能有效抑制［3H］－亮氨酸的摻入(圖3B)，表明我們制備的I－142單克隆抗體不影響氨基酸轉(zhuǎn)運。

圖3 I－142阻止纖連蛋白介導(dǎo)的細胞分布，但不影響氨基酸轉(zhuǎn)運(*P＜0.05)Fig.3 Antibody I－142 blocks fibronectin－mediated cell spreading but not amino acid transport.*P＜0.05

3 討論

約30年前，Haynes等［1］首次發(fā)現(xiàn) CD98是淋巴細胞的一種表面抗原;隨后 Hemler等［2，3］的研究表明，CD98在所有已建立的人體組織培養(yǎng)細胞系及大部分的人體惡性腫瘤細胞上均有表達。大量的研究表明，CD98參與許多特殊的細胞活動過程，如細胞粘附、融合、細胞增殖及生長，還參與不同類型細胞的氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運。

CD98是一個由2個亞基組成的二硫化物，包括一條糖基化的CD98重鏈和一條非糖基化的CD98輕鏈，其中CD98重鏈是一種含529個氨基酸的II型轉(zhuǎn)膜糖蛋白。已經(jīng)證實，CD98重鏈具有很多生物學功能，如調(diào)節(jié)整合素介導(dǎo)的細胞粘附;通過一個二硫鍵與CD98輕鏈形成異二聚體影響氨基酸的轉(zhuǎn)運;且具有調(diào)節(jié)細胞融合的功能。Feral等［8－10］的研究表明，CD98重鏈具有促進其他類型細胞增殖的能力，是由于其具有支持整合素信號通路而非氨基酸轉(zhuǎn)運的功能;而整合素介導(dǎo)的信號可以控制細胞的粘附/遷移、存活及 T細胞的增殖。免疫共沉淀結(jié)果顯示，我們建立的單克隆抗體，目標帶位于約75×103處。液相色譜分析顯示其目標分子為 CD98重鏈(CD98 heavy chain，CD98hc);同時，氨基酸轉(zhuǎn)運實驗及細胞粘附實驗結(jié)果顯示，我們所建立的單克隆抗體能有效抑制整合素介導(dǎo)的細胞粘附，但對氨基酸的轉(zhuǎn)運無影響，因為CD98重鏈與輕鏈通過二硫鍵形成二聚體控制氨基酸的轉(zhuǎn)運。因此，上述實驗結(jié)果證實，我們所建立的單克隆抗體的目標分子是CD98重鏈?；旌狭馨图毎磻?yīng)結(jié)果顯示，抗CD98hc單克隆抗體能有效抑制CD4+和CD8+T細胞增殖，首次揭示了CD98hc在T細胞的增殖過程中起著關(guān)鍵作用。

T細胞所介導(dǎo)的自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化癥，1型糖尿病等，是由于自身反應(yīng)性T細胞異常增殖導(dǎo)致的組織損傷所引發(fā)的［11，12］。T細胞表面表達有大量的共刺激受體及配體，能有效調(diào)節(jié)T細胞的增殖，功能性分化及其生存。研究顯示，通過單克隆抗體選擇性地作用于這些共刺激受體或配體，是治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的有效途徑。

我們所建立的抗CD98hc單克隆抗體，能有效地抑制CD4+和CD8+T細胞增殖，因此值得對其進行進一步的研究，探索將其用于T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的有效治療方法。

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