東方田鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

楊玉琴，馮潔，柏熊，沈志敏，劉雄偉，高捷，謝建云，胡建華，高誠(chéng)

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508;2.上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203;3.上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203)

近年來(lái)，由于飲食結(jié)構(gòu)的變化，非酒精性脂肪肝(non－alcoholic fatty liver，NAFL)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示脂肪肝病人已占到平均人口的10% ～24%，在發(fā)達(dá)國(guó)家已成為第一位常見肝病，且有進(jìn)展至肝硬化、肝癌、肝衰竭的危險(xiǎn)，已成為全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問題和社會(huì)問題［1－4］。

目前基本采用大鼠、小鼠、兔等動(dòng)物來(lái)建立NAFLD動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上對(duì)于這一疾病的發(fā)病機(jī)制、治療手段等方面進(jìn)行研究。高脂飲食能誘導(dǎo)出小鼠非酒精性脂肪肝模型，但小鼠不太適合長(zhǎng)時(shí)間給藥觀察研究［5］;兔雖也能建立模型但其抵抗力差，容易繼發(fā)感染而死亡［6］;目前比較常用的是大鼠和ob/ob小鼠，但這些動(dòng)物模型的病變特點(diǎn)是病變進(jìn)展很快，各期病變交叉出現(xiàn)，不能很好的體現(xiàn)病變的進(jìn)展過程，不利于疾病發(fā)病機(jī)制的研究和治療藥物的篩選［7－8］。因此迫切需要發(fā)掘新的動(dòng)物來(lái)建立非酒精性脂肪肝模型。

東方田鼠(Microtus fortis)隸屬于嚙齒目(Rodent)、倉(cāng)鼠科(Cricetidae)、田鼠亞科(Microtinae)、田鼠屬(Microtus)，是我國(guó)常見的嚙齒類動(dòng)物，其具有天然的對(duì)日本吸血蟲不感染的特性［9］。近些年來(lái)我們?cè)趯?duì)東方田鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室繁育過程中發(fā)現(xiàn)東方田鼠在實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng)下易發(fā)生脂肪肝病變［10］。本文旨在用東方田鼠建立一種新的非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6周齡湖南洞庭湖種群東方田鼠70只，雄性，體重40 g左右，普通級(jí)，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2008－0016】提供。實(shí)驗(yàn)在上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心進(jìn)行【SYXK(滬)2008－0058】。

1.2 主要試劑和材料

ALT、AST、ALP、r－GT、CHE、TG、TC、FFA、GLU、HDL和LDL檢測(cè)試劑購(gòu)自上海日和貿(mào)易有限公司(日本世諾臨床診斷制品株式會(huì)社);蘇木精(蘇木素hematoxylin，分子量320.29)購(gòu)自上海試劑三廠。

高脂肪料為在大小鼠的基礎(chǔ)料上添加5%豬油、0.5%膽固醇、0.1%膽鹽;高纖維料為在大小鼠的基礎(chǔ)料上添加粗纖維，使粗纖維的含量為10%、粗脂肪含量為3%，以上飼料均由上海市斯萊克斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司合成。

1.3 主要儀器

HBO100 ZEISS光學(xué)顯微鏡、KXL型自動(dòng)生化分析儀、RM2245切片機(jī)、EG1150H包埋機(jī)、TP1020脫水機(jī)、BSIOOS電子天平。

1.4 模型建立

湖南洞庭湖種群東方田鼠70只飼養(yǎng)于(20±2)℃、相對(duì)濕度60% ～70%、明暗各12 h的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為2組，每組35只，模型組飼喂高脂肪料，對(duì)照組飼喂高纖維料，動(dòng)物飲水均為高壓滅菌水，自由飲水取食。各組分別于造模開始后第 2、4、6、8、12周后處死實(shí)驗(yàn)鼠采樣。

1.5 動(dòng)物處理

動(dòng)物處死前先禁食8 h，稱重后乙醚麻醉，內(nèi)眥靜脈采血，處死，打開腹腔，肉眼觀察肝臟情況，并迅速取出肝臟稱肝重。取肝左葉同一部位1 cm×1 cm×1 cm組織置于4%甲醛溶液固定，用于制做病理切片。全血在室溫下靜置2 h后，4℃ 3500 r/min離心15 min分離血清，－20℃冷凍以備生化檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)觀察和測(cè)定方法

1.6.1 東方田鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)期間觀察食欲、行為、毛發(fā)、體重變化等，作詳細(xì)記錄，并計(jì)算肝指數(shù)(肝指數(shù) =肝重/體重 ×100%)。

1.6.2 測(cè)定方法

血清 ALT、AST、ALP、r－GT、CHE、TG、TC、FFA、GLU、HDL和LDL按試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行檢測(cè)。病理組織學(xué)檢查:肉眼觀察東方田鼠肝臟大體變化，對(duì)切片并作HE染色，光鏡下觀察東方田鼠肝臟脂肪變性情況，尤其注意肝臟的脂肪變性、炎性細(xì)胞、纖維化和壞死等病變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以()表示，各組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用兩樣本均數(shù)的 t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 東方田鼠一般情況

整個(gè)造模過程中，對(duì)照組東方田鼠生長(zhǎng)及生活狀況正常;模型組東方田鼠被毛普遍較稀疏，色澤不鮮，反應(yīng)較遲緩，食欲下降，隨著時(shí)間的推移，其被毛稀疏加重，有脫毛現(xiàn)象，色澤蠟黃。

2.2 肝臟指標(biāo)變化結(jié)果

2.2.1 一般指標(biāo)結(jié)果

從表1可見兩組田鼠隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)體重、肝重和肝指數(shù)均不斷增加，前4周，模型組田鼠體重比對(duì)照組有明顯增加(P＜0.05)，從第6周開始，兩組體重?zé)o明顯差異;然而從第6周開始模型組田鼠肝重和肝指數(shù)顯著增高(P＜0.05)，從第6周開始模型組田鼠肝指數(shù)大于5%。

表1 兩組東方田鼠體重、肝重和肝指數(shù)比較()Tab.1 Comparison of the body weight，liver weight and liver index between the two groups of Microtus fortis

表1 兩組東方田鼠體重、肝重和肝指數(shù)比較()Tab.1 Comparison of the body weight，liver weight and liver index between the two groups of Microtus fortis

注:*P＜0.05與對(duì)照組相比較;△P＜0.05與同組相比較Note:*P＜0.05 vs.control group;△P＜0.05 vs.the same group

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2.2.2 血清學(xué)結(jié)果

隨著造模時(shí)間的推移，模型組動(dòng)物血清 ALT、AST、CHE、r－GGT、GLU、TC、LDL 和 FFA 均有顯著升高，血清TG和HDL則逐漸降低，至第6周開始有顯著降低(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，模型組田鼠的TC、LDL、FFA水平在造模開始2周起就顯著升高(P＜0.05)，ALT、GLU、CHE 水平在 4周后顯著升高(P ＜0.05)，AST、r－GGT 水平在 12 周后也顯著升高(P＜0.05);隨著模型組田鼠TG和 HDL水平逐漸降低，至造模后期，較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)。詳見表2。

表2 兩組東方田鼠血清學(xué)指標(biāo)變化比較()Tab.2 Comparison of the serum biochemical indexes between the two groups of Microtus fortis

表2 兩組東方田鼠血清學(xué)指標(biāo)變化比較()Tab.2 Comparison of the serum biochemical indexes between the two groups of Microtus fortis

注:*P＜0.05與對(duì)照組相比較;△P＜0.05與同組相比較Note:*P＜0.05 vs.control group;△P＜0.05 vs.the same group.

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2.3 組織病理學(xué)結(jié)果

肝臟形態(tài)學(xué)觀察:對(duì)照組東方田鼠肝臟表面相對(duì)較光滑，紅潤(rùn)，無(wú)結(jié)節(jié)，質(zhì)軟。模型組田鼠不僅出現(xiàn)了肝體積增大，包膜緊張，而且肝臟呈現(xiàn)土黃色，切面油膩，并且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，程度更加明顯。

HE染色后光鏡下觀察，對(duì)照組東方田鼠肝臟在12周時(shí)部分肝細(xì)胞出現(xiàn)了輕度的脂肪變性，其余各組均無(wú)病變，肝細(xì)胞排列正常，細(xì)胞中央有大而圓的核，肝小葉規(guī)則，基本未見炎癥細(xì)胞。模型組在2周時(shí)幾張切片偶然出現(xiàn)小脂滴，但不明顯;4周時(shí)部分切片的肝細(xì)胞出現(xiàn)了小的脂肪滴;6周時(shí)所有切片的肝細(xì)胞均表現(xiàn)為脂肪變性，且為彌漫性脂肪變性，并出現(xiàn)了幾個(gè)較大的脂肪滴，肝細(xì)胞核相對(duì)大小不均;8周時(shí)脂肪滴進(jìn)一步融合，大脂肪滴在整個(gè)肝內(nèi)彌漫出現(xiàn);12周時(shí)均出現(xiàn)重度的脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以小葉內(nèi)為主。以上提示，6周時(shí)，模型組已經(jīng)成功發(fā)生非酒精性脂肪肝，并且隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，病變程度加重。詳見圖1(封二)。

注：A1-A5分別為模型組2、4、6、8和12周肝臟；B1-B5分別為對(duì)照組2、4、6、8和12周肝臟。圖1 肝臟的組織病理學(xué)變化（HE，×20）Note: A1-A5: Livers of the model group in 2, 4, 6, 8 and 12 weeks. B1-B5: Livers of the control group in 2, 4, 6, 8 and 12 weeks.Fig.1 Pathological changes of the livers (HE, ×20）

3 討論

目前高脂飲食誘導(dǎo)是建立非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型的常見方法。高脂飲食誘發(fā)性脂肪肝形成的影響因素較多，其中最主要的是血脂代謝異常，其表現(xiàn)有下兩種情況:一是由于血漿游離脂肪酸升高，被肝攝取并合成甘油三酯增多，血漿脂蛋白的形成跟不上游離脂肪酸進(jìn)入肝臟的速度，使甘油三酯在肝臟內(nèi)積聚而形成脂肪肝;二是由于血漿脂蛋白代謝障礙。極低密度脂蛋白的主要作用是將肝內(nèi)合成的甘油三酯通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至全身組織，極低密度脂蛋白形成減少，可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)合成的脂肪不易排出，從而誘發(fā)脂肪肝［11－13］。

本實(shí)驗(yàn)采用在大小鼠的基礎(chǔ)料上添加5%豬油、0.5%膽固醇、0.1%膽鹽的飼料對(duì)東方田鼠進(jìn)行飼養(yǎng)來(lái)建立東方田鼠非酒精性脂肪肝模型。模型組田鼠的體重、肝重、肝指數(shù)較對(duì)照組都有顯著性差異;血清中與脂肪代謝相關(guān)的指標(biāo) ALT、AST、CHE、r－GGT、GLU、TC、LDL 和 FFA 均有顯著升高，HDL 在造模的前4周升高，從第6周開始降低，然后迅速下降;并且肝臟病理切片顯示模型鼠在實(shí)驗(yàn)6周開始出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，其肝指數(shù)也大于5%。表明已成功建立了東方田鼠NAFLD模型。

但本模型也有一些指標(biāo)與人類NAFLD及其他模型動(dòng)物存在差異。首先在人和其他動(dòng)物NAFLD中，一個(gè)顯著的表現(xiàn)為 TG 升高［14－15］，但在本模型中，TG在造模的第2周比對(duì)照組升高，但隨后逐漸降低，直至第6周比對(duì)照組低，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，其數(shù)值不斷下降，表現(xiàn)出與人和其他動(dòng)物NAFLD顯著的不同，可能的原因是高脂飼料喂養(yǎng)的東方田鼠引起肝臟攝取脂肪酸增多，在造模的早期，肝臟合成的TG與載脂蛋白結(jié)合，運(yùn)至血液，而在造模后期，可能載脂蛋白形成障礙，從而造成脂肪酸積聚在肝臟無(wú)法以TG的形式轉(zhuǎn)運(yùn)至血液，導(dǎo)致東方田鼠模型組在造模的后期血清中TG的濃度不升反降。

其次，模型組動(dòng)物血清中ALP與對(duì)照組相比無(wú)差異。ALP是肝臟病變的一個(gè)重要指標(biāo)［16］，在中重度脂肪肝時(shí)肝細(xì)胞過度制造ALP，經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液引起血清堿性磷酸酶明顯升高［15］，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的病理結(jié)果，模型田鼠肝內(nèi)出現(xiàn)了大量的脂肪變性，只有在造模12周時(shí)才見到較多的炎細(xì)胞，并未見到顯著地纖維化病變，還未引起肝細(xì)胞的嚴(yán)重病變，說(shuō)明建立的模型可能病變進(jìn)展較為緩慢，有一定的疾病演變過程，這樣的模型可以更好的用于發(fā)病機(jī)制和臨床藥物的研究。

大鼠非酒精性脂肪肝模型是近些年來(lái)建立的較成熟的模型，而大鼠建模飼料需要在一般普通基礎(chǔ)飼料基礎(chǔ)上再加上2%膽固醇、5% ～10%豬油［17－18］。而本次東方田鼠的建模飼料是在普通大小鼠料的基礎(chǔ)上只添加5%豬油、0.5%膽固醇、0.1%膽鹽，用脂肪含量較低的飼料在短期內(nèi)就建立了東方田鼠非酒精性脂肪肝模型，并且其模型成功模擬了人類非酒精性脂肪肝病變的演變過程。

本次用東方田鼠建立的非酒精性脂肪肝模型，與其他動(dòng)物建立的模型相比有以下特點(diǎn):⑴模型較容易建立，在6周就出現(xiàn)了明顯的脂肪肝病變;⑵其血清甘油三酯在造模前期增高，而隨后卻明顯降低;⑶本研究中病理結(jié)果顯示我們的模型組并未出現(xiàn)明顯的纖維化，血清指標(biāo)中ALP也無(wú)顯著差異，說(shuō)明肝臟無(wú)明顯的纖維化病變。

以上研究結(jié)果顯示我們建立的東方田鼠非酒精性脂肪肝模型具有模型易構(gòu)建和病變有一定進(jìn)展過程等優(yōu)點(diǎn)，可以用于發(fā)病機(jī)制和早期臨床藥物干預(yù)等方面的研究。本文只是對(duì)東方田鼠非酒精性脂肪肝模型進(jìn)行初步研究，若想確切了解本模型的發(fā)病機(jī)制及這一模型與其他模型的區(qū)別仍需進(jìn)一步深入研究。

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