實時定量RT-PCR芯片技術(shù)篩選乳腺癌術(shù)后復發(fā)相關(guān)基因

唐金海， 吳建中， 馮繼鋒， 李蘇平， 趙建華

乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后和生存的關(guān)鍵因素，其發(fā)生機制目前還不十分清楚?，F(xiàn)有的理論和研究傾向于認為原發(fā)性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移特性以及雌激素受體信號傳導通路的活化狀態(tài)在很大程度上決定了其術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移的可能性[1]。研究乳腺癌細胞的這些表型特征，并通過相關(guān)基因及其表達譜的檢測，達到準確而有效地預(yù)測腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的目的，以指導臨床個體化治療，是乳腺癌研究急待解決的課題。本研究擬應(yīng)用快速、簡便、準確和高通量的實時定量RT-PCR芯片技術(shù)篩選并確定一組與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的特征基因，探討其表達在疾病發(fā)展如術(shù)后復發(fā)中的預(yù)測價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2002年5月至2005年3月期間在江蘇省腫瘤醫(yī)院普外科診治并行乳腺癌根治術(shù)，且保存有完整石蠟包埋組織樣本的乳腺癌病例。根據(jù)術(shù)后5年隨訪期內(nèi)患者是否出現(xiàn)復發(fā)進行分組，選取復發(fā)轉(zhuǎn)移者41例為研究組(包括因復發(fā)轉(zhuǎn)移而死亡者7例)，未復發(fā)仍存活者40例為對照組。所有病例均有完整的病歷和隨訪資料，兩組病例的病理學特征見表1。

表1 研究組和對照組乳腺癌患者的臨床病理特征

a由于某特性未知，病例數(shù)并非總是81例；b由于某特性未知，病例數(shù)并非總是41例；c由于某特性未知，病例數(shù)并非總是40例；

*美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)乳腺癌分期(2002年第6版)

1.2 石蠟包埋組織RNA的提取及其純度鑒定 利用顯微鏡專用薄片切取機從石蠟包埋組織塊的中央切取數(shù)片5～20 μm的組織薄片，嚴格按RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit說明書(Applied Biosystems公司)操作，提取RNA；在全波長自動酶標儀260和280 nm波長處分別檢測其吸光度(A)值，根據(jù)A260/A280鑒定RNA純度和A260計算其濃度。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增 取1 μg總RNA，按Full SpectrumTMComplete Transcriptome RNA Amplification Kit(System Biosciences公司)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(20 μL)，用無核酸酶的水稀釋至111 μL；再取其中102 μL cDNA作為模板加入到PCR反應(yīng)體系(RT2Real-TimeTMSYBR Green PCR Master Mix)中至終體積2 700 μL，混勻后，在RT2ProfilerTMPCR Array System的96孔板(SABiosciences 公司)各孔中，加入25 μL等量的PCR反應(yīng)體系，進行實時定量擴增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s、60℃ 1 min，50個循環(huán) (BIO-RAD ICycle熒光定量擴增儀)。

PCR芯片(RT2ProfilerTMPCR Array System)是專為實時熒光定量PCR設(shè)計的96孔反應(yīng)板，每孔中已預(yù)置了經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計的用以擴增靶cDNA片段的上、下游引物；其設(shè)置順序為：A1-G12孔包含了與乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的84個靶基因的引物；H1-H5孔包含了5個管家基因(β-2-微球蛋白，次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，1、3-磷酸甘油醛脫氫酶，核糖體蛋白L13a和β-肌紅蛋白)，用于靶基因定量數(shù)據(jù)的標化；H6為基因組DNA參照(GDC)，其中固定的引物能特異性地檢測未轉(zhuǎn)錄的基因組DNA重復片段，以監(jiān)測樣本中是否存在DNA污染；H7到H9是3個重復孔，均為逆轉(zhuǎn)錄參照(RTC)，用于檢測逆轉(zhuǎn)錄效率。H10到H12是陽性PCR參照(PPC)，用于反映PCR反應(yīng)的效率；這兩組重復的對照RTC和PPC也可用于監(jiān)測芯片間和芯片內(nèi)測定的一致性。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件包，樣本率的比較采用χ2檢驗。各靶基因表達的定量數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗為非正態(tài)分布；靶基因表達水平的高低分界(Cut-off值)采用的是所有病例(包括研究組和對照組)檢測結(jié)果的中位數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取質(zhì)量 抽提81份樣本總RNA，A260/A280均在1.63～2.01之間；且所有樣本的5個管家基因RT-PCR檢測，除14份樣本有1個管家基因、10份樣本有2個管家基因以及3份樣本有3個管家基因沒有檢測到擴增信號外，其余均有典型的擴增曲線，說明抽提的RNA質(zhì)量符合要求。

2.2 RT-PCR芯片測定結(jié)果 圖1顯示的是1例復發(fā)患者樣本的96孔板1次檢測的擴增曲線，其中的5個管家基因和7個質(zhì)控對照均符合試劑盒的測定要求。研究組與對照組相比較，在84個已知靶基因中，有12個基因的表達改變具有統(tǒng)計學意義(14.3%；P<0.05；表2)。其中9個基因表達上調(diào)(10.7%)，包括AR、CCNA2、CCND1、CD44、HMGB1、MKI67、NFYB、NGFR和TOP2A；3個基因表達下調(diào)(3.57%)，包括ESR2、SPRR1B和KLF5。這些基因主要涉及細胞增殖、分化和凋亡，細胞遷移和粘附，細胞周期調(diào)控以及細胞內(nèi)激素信號傳導等功能。

圖1 1例復發(fā)患者樣本的96孔板1次檢測的擴增曲線

基因代碼高表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)低表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)P值基因代碼高表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)低表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)P值A(chǔ)R37．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035IL6R50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913BAD52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579IL6ST55．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318BAG158．5(24/41)41．5(17/41)40．0(16/40)60．0(24/40)0．950ITGA642．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221BCL252．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579ITGB442．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221BCL2L255．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318JUN47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(20/41)48．8(21/41)0．738C350．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913KIT47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738CCNA142．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221KRT1843．6(17/39)56．4(22/39)54．8(23/42)45．2(19/42)0．315CCNA233．3(13/39)66．7(26/39)64．3(27/42)35．7(17/42)0．005KRT1948．7(19/39)51．3(20/39)56．1(21/42)43．9(21/42)0．908CCND137．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035MAP2K741．5(17/41)58．5(24/41)57．5(23/41)42．5(17/41)0．149CCNE147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738MKI6737．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035CD4433．3(13/39)66．7(26/39)64．3(27/42)35．7(15/42)0．005MT353．7(22/41)46．3(19/41)45．0(18/40)55．0(22/40)0．436CDH147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738MUC155．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436CDKN1A55．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318NFYB37．5(15/40)62．5(25/40)61．0(25/41)39．0(16/41)0．035CDKN1B52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579NGF45．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．707CDKN2A47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738NGFR36．3(15/40)63．4(26/40)62．5(25/41)37．5(15/41)0．020CLDN752．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579NME160．0(24/40)40．0(16/40)39．0(16/41)61．0(25/41)0．059CLU52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579PAPPA45．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436COL6A147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738PGR42．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221CTNNB142．5(17/40)57．5(23/40)48．8(23/41)56．1(18/41)0．221PLAU55．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318CTSB50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913PTEN50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913CTSD52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579PTGS247．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738

續(xù)表

基因代碼高表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)低表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)P值基因代碼高表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)低表達%(n/n)未復發(fā)復發(fā)P值CYP19A140．0(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．095RAC242．5(17/40)57．5(23/40)56．1(23/41)43．9(18/41)0．221DLC147．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738RPL2747．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738EGFR57．5(23/40)42．5(17/40)41．5(17/41)58．5(24/41)0．149SCGB1D245．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436ERBB250．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913SCGB2A147．5(19/39)51．3(20/39)50．0(21/42)50．0(21/42)0．908ESR155．0(22/40)45．0(18/40)43．9(18/41)56．1(23/41)0．318SERPINA338．5(15/39)61．5(24/39)59．5(25/42)40．5(17/42)0．058ESR262．5(25/40)37．5(15/40)36．6(15/41)63．4(26/41)0．020SERPINB547．5(23/39)52．5(16/39)40．5(17/42)59．5(25/42)0．096FAS52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579SERPINE151．3(20/39)48．7(19/39)47．6(20/42)52．4(22/42)0．742FASLG50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913SLC7A545．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436FGF143．2(16/37)56．8(21/37)54．5(24/44)45．5(20/44)0．311SPRR1B62．5(25/40)37．5(15/40)36．6(15/42)63．4(26/42)0．020FLRT140．0(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．913STC247．5(19/40)57．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738FOSL160．0(24/40)40．0(16/40)39．0(16/41)48．8(25/41)0．059TFF150．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913GABRP40．0%(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．095TGFA50．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913GATA359．0(23/39)41．0(16/39)40．5(17/41)59．5(25/41)0．096THBS148．7(16/40)51．3(24/40)50．0(21/41)50．0(21/41)0．908GNAS47．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738THBS245．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436GSN52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579TIE152．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579HMGB135．0(14/40)65．0(26/40)63．4(26/41)36．6(15/41)0．011TNFAIP252．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579HSPB140．0(16/40)60．0(24/40)58．5(24/41)41．5(17/41)0．095TOP2A35．0(14/40)65．0(26/40)63．4(26/41)36．6(15/41)0．011ID250．0(20/40)50．0(20/40)48．8(20/41)51．2(21/41)0．913TP5347．5(19/40)52．5(21/40)51．2(21/41)48．8(20/41)0．738IGFBP252．5(15/40)61．5(24/40)59．5(25/41)40．5(17/41)0．058VEGFA52．5(21/40)47．5(19/40)46．3(19/41)53．7(22/41)0．579IL2RA45．0(18/40)55．0(22/40)53．7(22/41)46．3(19/41)0．436KLF560．0(25/39)40．0(14/39)35．7(15/41)64．3(27/41)0．011IL651．3(20/39)52．5(19/39)47．6(20/42)52．4(22/42)0．742KLK560．0(24/40)40．0(16/40)39．0(16/41)48．8(25/41)0．059

3 討論

實時定量PCR是目前公認的檢測基因表達最靈敏、最可靠的方法，其線性范圍廣(5個數(shù)量級)，可以檢測同一樣本中表達量極低和表達量很高的基因，常用于驗證基因芯片結(jié)果的有效性；但缺點是每次實驗只能檢測少數(shù)幾個基因的表達水平，若要檢測大量基因，則工作量巨大，耗時費力。本文所采用的RT2Profiler PCR芯片技術(shù)結(jié)合了實時定量PCR的優(yōu)點和芯片的高通量，1次可同時檢測84個基因，且同步擴增的5個管家基因和7個質(zhì)控對照，可有效監(jiān)測結(jié)果的假陰性、假陽性、重復性以及轉(zhuǎn)錄和擴增效率，從而確保了檢測質(zhì)量。

乳腺癌是一種性激素依賴性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展與性激素受體狀況密切相關(guān)。據(jù)報道AR(雄激素受體)在70%以上乳腺癌以及45%～50%雌激素受體(ER)陰性乳腺癌患者中表達[2]。在本研究中，AR在乳腺癌術(shù)后復發(fā)患者中表現(xiàn)為高表達，可能與雄激素可促進乳腺癌形成并加速其發(fā)展的作用有關(guān)。Moinfar等[3]報道ER、PR(孕激素受體)陰性而AR陽性乳腺癌患者，癌細胞分化低惡性程度高。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)細胞周期失控是癌變的重要原因，并進一步揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展主要是G1～S期的轉(zhuǎn)換失調(diào)[4]。在本組乳腺癌術(shù)后復發(fā)患者中，與細胞周期G1/S期阻滯有關(guān)的CCNA2(細胞周期蛋白A2，又稱Cyclin A2)和CCND1(Cyclin D1)基因表達明顯上調(diào)；他們可導致癌細胞周期失控，出現(xiàn)以增殖為主的失控性生長[5]；同時，與細胞遷移及粘附有關(guān)的基因如HMGB1(高遷移率族蛋白B1)和CD44(粘附分子跨膜糖蛋白)的高表達，又促進了這些快速增長的癌細胞向宿主細胞及其基質(zhì)遷移、粘附和轉(zhuǎn)移的過程[6]。此外，篩選出來的上調(diào)基因還有MKI67(核增殖抗原)、NFYB(核轉(zhuǎn)錄因子Y，β)和NGFR(神經(jīng)生長因子受體)，據(jù)報道也與癌細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1，7]。乳腺癌細胞能分泌神經(jīng)生長因子(NGF)并表達NGFR，而正常乳腺上皮細胞不能分泌NGF，但能表達NGFR；有趣的是，NGF只能與乳腺癌細胞上的NGFR結(jié)合，發(fā)揮促進細胞的有絲分裂和抗凋亡生物學效應(yīng)，而對正常乳腺上皮細胞則沒有此作用[7]。Adriaenssens等[8]研究發(fā)現(xiàn)，以NGF為靶點的治療，可有效抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，同時還可促進細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成。

上調(diào)基因TOP2A(拓撲異構(gòu)酶IIα)是近年乳腺癌研究的熱點。2008年美國食品藥品管理局(FDA)批準了名為TOP2A FISH pharmDx的試劑盒，用于評估相對高風險乳腺癌患者的腫瘤復發(fā)風險和長期生存率。美國臨床學會(ASCO)2008國際乳腺癌專題研討會上，北美乳腺癌協(xié)作組的一項研究表明，對于激素受體陽性、Her-2正?；颊?，TOP2A基因RNA表達與復發(fā)高度相關(guān)(校正P=0.01)，多變量分析表明，TOP2A表達每增加5單位，復發(fā)風險比(HR)為5.6(P=0.008)[9]。

下調(diào)基因有ESR2(雌激素受體2)、SPRR1B(small proline-rich protein 1B)和KLF5(krupple like factor 5)。雌激素受體(ER)是一個核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控基因表達，雌激素通過ER介導的信號傳導在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。王殊等[10]研究發(fā)現(xiàn)ER1在乳腺癌組織的表達明顯高于癌旁正常組織，而ER2在癌組織的表達明顯低于癌旁正常組織，ER1/ER2比值在癌組織中明顯增高；如果ER2水平下調(diào)，其對ER1的抑制作用減弱，可導致細胞對雌激素的敏感性增加，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。SPRR1B是鱗狀細胞化生的一個生物學標志，在皮膚和呼吸道鱗狀上皮細胞的分化中起重要作用。最近，Tesfaigzi等[11]報道SPRR1B在非鱗狀細胞(如腺癌細胞)中也有表達，其過表達可促進細胞進入G0期，低表達很可能加快細胞進入增殖期。KLF5是KLF家族中與胚胎發(fā)育、細胞增殖和腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其在乳腺癌中的作用，近年來也受到廣泛關(guān)注，多數(shù)研究的重點是KLF的致癌機制。也有些研究[12]認為KLF5表達與癌細胞增殖活性直接相關(guān)，可作為乳腺癌新的預(yù)后因子。不過，這些研究目前主要局限于西方國家，結(jié)果也存在著不一致，需要進一步在多種族人群中開展研究。

綜上所述，本研究的結(jié)果初步表明，乳腺癌的術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移涉及到一些基因的表達改變，對這些基因的進一步深入研究無疑有助于乳腺癌復發(fā)機制的闡明，并為臨床更有效的預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

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