人卵巢癌細(xì)胞系OV1228的建立及其生物學(xué)特性

王金華， 趙萬洲， 陳小祥， 趙一兵， 曲軍衛(wèi)， 彭素蓉

惡性腫瘤體外細(xì)胞系的培養(yǎng)和建立，為惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究提供了非常重要的實(shí)驗(yàn)手段和實(shí)驗(yàn)材料，在惡性腫瘤發(fā)病機(jī)理及新的治療措施探討中起著重要作用。卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，其病死率高居各類婦科腫瘤的首位，體外建立卵巢癌細(xì)胞系及實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停兄匾囊饬x。本研究自2007年12月從人復(fù)發(fā)性卵巢癌獲取原代培養(yǎng)細(xì)胞以來，歷時18個多月，傳代80余代，在體外成功建立起人卵巢癌細(xì)胞系，命名為OV1228，現(xiàn)將其建立過程及生物學(xué)特性報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清,青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，0.125%胰酶，0.05% 四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，0.1% Triton X-100，Tris HCl(pH 7.4)，0.55 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl等。

1.2 人卵巢癌細(xì)胞株OV1228的建立

1.2.1 一般資料 患者，女性，59歲，于2007年12月28日行卵巢癌腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)。部分卵巢腫瘤標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，制片(4 μm厚)，HE染色。由病理專業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下閱片，癌變狀況如圖1所示，癌組織位于表面，多層排列，癌細(xì)胞核大、深染，有明顯的異型性。

圖1 人卵巢癌OV1228細(xì)胞原組織來源病理切片(×200)

1.2.2 腫瘤標(biāo)本及處理 取部分無壞死的新鮮腫瘤組織標(biāo)本在層流超凈臺上，用Hank′s液洗滌2次后，剪成1 mm3大小組織，于200目金屬網(wǎng)篩上用注射器針?biāo)ㄝp輕研磨，用含青、鏈霉素的培養(yǎng)液RPMI 1640沖洗、過篩，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)單克隆化生長后調(diào)細(xì)胞濃度為5×104/mL，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，取不同代數(shù)的細(xì)胞凍存于-196℃液氮中保種，同時進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性分析。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

相差顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)，并進(jìn)行攝影；另接種細(xì)胞于100 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后用胰酶-EDTA液消化分散細(xì)胞，收集于10 mL管內(nèi)離心成細(xì)胞小團(tuán)，經(jīng)2.5%戊二醛鋨酸雙固定，Epon 812包埋，超薄切片、染色，在H-600型電鏡下觀察。

1.4 細(xì)胞生長曲線測定

以2.5×104/mL接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h，從次日起，每天計數(shù)3孔細(xì)胞，取均值，連續(xù)7 d，繪制細(xì)胞生長增殖曲線，根據(jù)Patterson公式，計算細(xì)胞在對數(shù)生長期的倍增時間[1]。

1.5 軟瓊脂集落形成率

將1.25%的瓊脂煮沸溶解，稀釋成0.5%的瓊脂，加于60 mm平皿內(nèi)，凝固后將含單細(xì)胞的0.33% 的瓊脂液接種于底層瓊脂上，接種密度為5.0×104個細(xì)胞/皿，置37℃，5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，15 d后計數(shù)含30個細(xì)胞以上的集落，按公式計算出集落形成率[2]：集落形成率=(集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 核型分析

細(xì)胞傳代后培養(yǎng)2 d，加入秋水仙素(1 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)2 h后收獲細(xì)胞，按常規(guī)方法制備染色體進(jìn)行核型分析。

1.7 裸鼠接種

裸鼠購自北京動物所，接種細(xì)胞時鼠齡為6周，培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液接種于6只裸鼠右腋部皮下，每只裸鼠注射0.3 mL(1.0×107個細(xì)胞)，無菌條件下喂養(yǎng)，每周檢查3～4次，4周左右，當(dāng)瘤體總直徑達(dá)1 cm 以上時照相后處死，取出腫塊作病理切片檢查。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下可見卵巢癌細(xì)胞邊緣清晰,形態(tài)以多角形、梭形或圓形卵石狀排列，見圖2A。透射電鏡顯示：瘤細(xì)胞呈簇或散在分布，細(xì)胞無明顯壞死和凋亡，細(xì)胞卵圓形或多邊形，胞質(zhì)豐富，表面有少量短的細(xì)胞突起，部分細(xì)胞間可見發(fā)育比較差的橋粒樣結(jié)構(gòu)，胞質(zhì)電子密度低，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器稀少，可見少量線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，散在分布少量糖原顆粒，具有明顯的惡性卵巢癌細(xì)胞特征，見圖2B。

圖2 光學(xué)和電子顯微鏡觀察OV1228細(xì)胞形態(tài)A：倒置顯微鏡顯示的卵巢癌原代細(xì)胞(×40)；B：電鏡顯示OV1228細(xì)胞表面有少量短的細(xì)胞突起，具有明顯的惡性卵巢癌細(xì)胞特征(bar=1 μm)

2.2 OV1228細(xì)胞群體倍增時間的測定

根據(jù)每天記錄的細(xì)胞平均數(shù)，在座標(biāo)紙上繪出細(xì)胞生長曲線，可見細(xì)胞在7～8 d達(dá)到峰值，細(xì)胞群體倍增時間為29.39 h(圖3)。

圖3 OV1228細(xì)胞生長曲線

2.3 細(xì)胞集落形成率

細(xì)胞在軟瓊脂中培養(yǎng)15 d后，在倒置顯微鏡下計算>30個細(xì)胞的集落，根據(jù)公式計算出的集落形成率為17.5%。

2.4 核型分析

對第50代細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色體分析，細(xì)胞核型為多倍體，染色體數(shù)目波動在21～61條之間，多為亞二倍體，少數(shù)超三倍體。分析發(fā)現(xiàn)染色體、染色單體斷片，環(huán)狀染色體、雙微體、三射體等染色體畸變，畸變率為21.95%，見圖4。

圖4 OV1228細(xì)胞的核型分析(×1 000倍，Giemsa染色)

2.5 異體致瘤性

卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠腋部皮下后，于第3周在接種部位出現(xiàn)腫瘤生長，見圖5。第4周取出腫塊，其腫塊直徑在1.2～1.8 cm之間，腫塊病理組織學(xué)檢查表明其卵巢癌細(xì)胞形態(tài)與原實(shí)體瘤相似。

圖5 OV1228移植裸鼠腋部皮下后長出腫塊

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個十分復(fù)雜的過程，受各種生物因素的影響。在體內(nèi)直接研究癌細(xì)胞的生物學(xué)特性有較大的難度，受到很多因素的制約，而在體外建立永生化的癌細(xì)胞系可免受機(jī)體內(nèi)各種因素的干擾，便于探討各種物理、化學(xué)、生物等因素對癌細(xì)胞生命活動的影響，特別是在抗癌藥物的篩選及腫瘤免疫治療與基因治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。因此，建立人癌細(xì)胞系是研究人類腫瘤必不可少的重要手段。

癌細(xì)胞體外建系是一個漫長而復(fù)雜的過程，特別是用原發(fā)腫瘤組織直接體外培養(yǎng)建系被認(rèn)為成功率極低[3]。但我們在研究文獻(xiàn)[4]的基礎(chǔ)上，從19例培養(yǎng)標(biāo)本中成功應(yīng)用原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)并通過克隆稀釋法建立起人卵巢癌腫瘤細(xì)胞株OV1228，這些癌細(xì)胞在體外傳25代后，生長速度明顯加快，并具有無限增殖能力。腫瘤生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)都具有腺上皮細(xì)胞癌結(jié)構(gòu)的特性，但細(xì)胞分化較差，具有高度異體致瘤性等惡性特征。以上特征說明，我們已成功建立起新的人卵巢癌細(xì)胞株。OV1228卵巢癌細(xì)胞系的建立，豐富了人卵巢癌細(xì)胞系的類型，為進(jìn)一步研究卵巢癌的生物學(xué)特征提供了合適的體外模型。

[1] 韓麗妹,潘弘,方曉玲.人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株的建立和生物學(xué)特性評價[J].復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，35(2)：171-175.

[2] 祝和成,姚開泰,李桂源,等.4株上皮細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性[J]. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1992,17(2):103-107.

[3] 盛修貴,孫廣蓮,曲牟文,等.人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HECCL21 的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察[J].腫瘤防治雜志,2002, 9(2):123-126.

[4] 吳尚輝，鄧朝暉，祝斌，等.一株新的卵巢癌細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性分析[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，12(1)：27-29.