p53基因治療晚期肝癌的初步生物學(xué)監(jiān)測研究

馬國建， 沈宗麗， 陳森清， 徐衛(wèi)東， 李金田， 陳世晞

復(fù)發(fā)和廣泛轉(zhuǎn)移使得肝癌尤其是晚期肝癌成為人類最難治的腫瘤之一，目前介入治療仍是晚期肝癌和無法手術(shù)肝癌患者首選和最有效的治療方法。隨著介入治療技術(shù)的日臻發(fā)展，p53基因介入治療肝癌已成為新的研究熱點[1-2]。但目前的研究大多停留在動物實驗基礎(chǔ)上，對于治療效果的評判，也只是臨床的一些生理觀察指標(biāo)[3-4]，p53表達(dá)的變化及相應(yīng)的生物學(xué)研究尚少。本研究隨機(jī)選取了1組晚期肝癌患者，對其進(jìn)行了動脈灌注人重組腺病毒p53(rAd-p53)介入治療，從細(xì)胞及分子生物學(xué)角度對晚期肝癌基因介入治療前后的效果，進(jìn)行了生物學(xué)監(jiān)測研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 實驗材料取自晚期肝癌患者外周血，患者全部來自本院介入科，隨機(jī)抽取晚期肝癌51例，其中男性47例，女性4例，年齡30～70歲。治療方案為：動脈灌注重組人腺病毒p53注射液1012VP，加羥基喜樹堿20 mg，每周1次，連用4次。介入治療前及完成4次治療后，每例患者都無菌采集抗凝外周血5 mL，將外周全血分成2份，供不同生物學(xué)測試終點檢測用。

1.2 突變型p53表達(dá)測定 直標(biāo)法測定，用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測，流式細(xì)胞儀為美國BD公司的Facs Calibur，15 mw氬離子激光,激發(fā)光波長488 nm。取1 mL 抗凝外周血，用淋巴細(xì)胞分層液分離外周血中的單核細(xì)胞，PBS液洗滌，洗滌后用70%乙醇固定后過夜。離心除去乙醇，用PBS液洗滌，通過淋巴細(xì)胞分離液梯度離心后可除去90%的白細(xì)胞，而留下的主要是單核細(xì)胞，其中包括可能存在于外周血中的腫瘤細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL。加入鼠抗人突變型p53-FITC單抗，并設(shè)同型試劑本底對照管，暗處反應(yīng)30 min， PBS液洗滌后上細(xì)胞儀。用Cellguest軟件自動獲取104細(xì)胞/樣品并分析結(jié)果，記錄p53陽性細(xì)胞百分率。

1.3 體內(nèi)淋巴細(xì)胞微核實驗 將新鮮抗凝血立即進(jìn)行微核制片。用200 μL加樣器取抗凝全血0.1 mL，加入到0.5 mL Tip管(硅化過更好)。再加入0.05 mL 3%明膠(生理鹽水37℃水浴，臨時配制)，混勻、無氣泡后，37℃水浴45 min，吸上清液于另一0.5 mL Tip管內(nèi)，離心，微量沉淀物用震蕩器混勻，以10 μL加樣器吸出，推片，風(fēng)干，在純甲醇中固定1 min，Giemsa染色。每例計數(shù)2 000個完整淋巴細(xì)胞，記錄微核細(xì)胞數(shù)。分析指標(biāo)與注意事項等詳細(xì)內(nèi)容見參考文獻(xiàn)[5]。

1.4 統(tǒng)計分析 肝癌患者治療前后體內(nèi)自發(fā)微核率差異用U檢驗，突變型p53表達(dá)率的差異用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者介入治療前后p53表達(dá)的動態(tài)變化 晚期肝癌患者動脈灌注人重組腺病毒p53進(jìn)行介入治療，按完成4次治療為有效介入治療計，共獲取有效病例18例。患者突變型p53平均表達(dá)率在介入治療后，明顯下降，治療前后比較(治療前平均23.74%，治療后平均11.81%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

表1 患者介入治療前后p53表達(dá)的動態(tài)變化

2.2 p53基因治療前后患者體內(nèi)自發(fā)微核形成的變化 計數(shù)51例晚期肝癌患者p53介入治療前與經(jīng)2～4次介入治療后獲得的有效病例39例的平均自發(fā)微核率(MNF)。介入治療后患者的平均MNF和自然人群(對照組)的平均MNF相比較，P值均<0.01，差異極顯著；與治療前的平均MNF相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 肝癌患者自發(fā)體內(nèi)微核形成率與對照組的比較

*和介入治療前組比較。

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個多因素、多基因、多階段和多途徑的復(fù)雜過程，是遺傳與環(huán)境風(fēng)險因子相互作用對體細(xì)胞基因組穩(wěn)定性影響的結(jié)果之一。包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的人類惡性腫瘤中至少有50%發(fā)生了p53基因改變，失去有功能的p53蛋白。某些肝癌含有突變的等位基因和一個正常的等位基因，另外一些肝癌含有一個突變的等位基因和一個缺失的等位基因。我國肝細(xì)胞癌的p53等位基因缺失率高。將正常的腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可代替和補(bǔ)償缺陷的基因以抑制腫瘤的生長，因此，抑制基因治療是從根本上攻克腫瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，動脈灌注p53基因介入治療肝癌是肝癌介入治療新的研究熱點，大量研究證實了在體外通過導(dǎo)入野生型p53能夠重建肝癌細(xì)胞內(nèi)變異的p53功能,并可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放療敏感性[6]；并且還發(fā)現(xiàn)rAd-p53對內(nèi)源性p53基因呈突變型的肝癌細(xì)胞的治療及放療增敏作用強(qiáng)于對野生型p53基因肝癌細(xì)胞的作用[7]。同時有研究還發(fā)現(xiàn)，rAd-p53可有效增加肝癌細(xì)胞QGY-7703的凋亡[8]，阻滯腫瘤細(xì)胞進(jìn)入G1期并提高放射治療的增感效應(yīng)[9]。但現(xiàn)有的研究多數(shù)只停留在動物實驗基礎(chǔ)或體外實驗研究上，鮮見用于臨床實踐的病例。本項研究以外周血循環(huán)癌細(xì)胞中突變型p53表達(dá)率和體內(nèi)自發(fā)微核為測試終點，從細(xì)胞和分子水平，同時對動脈灌注p53基因介入治療的晚期肝癌患者進(jìn)行了生物學(xué)觀測。實驗結(jié)果顯示：本組隨機(jī)選取的晚期肝癌患者，經(jīng)動脈灌注p53基因介入治療后，患者外周血突變型p53表達(dá)顯著下降，和治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。另外，患者自發(fā)微核率治療后也呈下降趨勢，與治療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且患者外周血p53表達(dá)和微核形成的動態(tài)變化與患者臨床癥狀緩解密切相關(guān)。這一研究結(jié)果目前在同類研究中尚未見類似報道。

循環(huán)外周血代表了機(jī)體的內(nèi)環(huán)境與穩(wěn)態(tài)，能從整體水平反映出機(jī)體的生命活動變化。已有大量實驗證據(jù)表明，腫瘤患者外周血循環(huán)中存在一定數(shù)量的癌細(xì)胞，并可富集由腫瘤組織釋放的并以穩(wěn)定狀態(tài)存在的DNA分子等腫瘤代謝產(chǎn)物[10]。本研究實驗結(jié)果顯示，肝癌患者外周血循環(huán)中確實存在較高比例的游離腫瘤細(xì)胞，游離在外周血中的腫瘤細(xì)胞p53突變蛋白半衰期較長，在循環(huán)外周血中不易消失；雖然部分存在于外周血循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞可能已經(jīng)處于凋亡狀態(tài)，其細(xì)胞內(nèi)的成分已經(jīng)發(fā)生了變化，但p53突變蛋白仍然存在，經(jīng)敏感的檢測方法可得到陽性檢測結(jié)果。另外，體內(nèi)自發(fā)微核可作為染色體損傷、基因組不穩(wěn)定性和終末腫瘤風(fēng)險因子的生物學(xué)標(biāo)志物，同時微核的存在可綜合反映染色體不穩(wěn)定性表型及由于基因缺失、外源性誘變劑造成的細(xì)胞生存力改變[11]。本研究采用體內(nèi)微核實驗及循環(huán)癌細(xì)胞p53檢測，對動脈灌注重組人腺病毒p53治療晚期肝癌患者進(jìn)行動態(tài)生物學(xué)觀察，獲得了有效的實驗數(shù)據(jù)，這將對晚期肝癌基因治療的用藥劑量和療效評估有積極的生物學(xué)指導(dǎo)和監(jiān)測作用，但還需進(jìn)一步擴(kuò)大治療病例加以驗證。

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