pIRES2-EGFP-hIL-10真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

陳麗紅 劉景豐 方航榮 邱明鏈

[摘要] 目的 構(gòu)建帶有報(bào)告基因EGFP的hIL-10真核表達(dá)載體。方法 通過RT-PCR方法從人外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增出IL-10基因,構(gòu)建IL-10基因和報(bào)告基因EGFP基因真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hIL-10,經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序等方法進(jìn)行鑒定,紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度及純度。結(jié)果 酶切、PCR及測(cè)序證實(shí)pIRES2-EGFP-hIL-10載體序列正確。結(jié)論 成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hIL-10,可為后續(xù)器官移植免疫耐受的研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 基因;IL-10基因;真核表達(dá)載體;載體構(gòu)建

[中圖分類號(hào)] Q754[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701(2009)34-01-03

Construction and Identification of pIRES2-EGFP-hIL-10 Plasmid

CHEN Lihong1LIU Jingfeng2FANG Hangrong1QIU Minglian2

1.Department of Pathology,Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China;2.The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350004,China

[Abstract] Objective To construct the pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid of human. Methods IL-10 gene was amplified from human peripheral blood lymphocytes by using RT-PCR,and then pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid was constructed. The identification was done by using endonuclease cutting,PCR and sequencing and the plasmid concentration and purity were detected by using UV spectrophotometer. Results Endonuclease cutting. PCR andsequencing showed the successful construction of pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid.Conclusion We construct pIRES2-EGFP-hIL-10 plasmid successfully and lay the foundation for immunotolerance researchesin the organ transplantation.

[Key words] Gene;IL-10 gene;Eukaryotic expression vector;Vector construction

白細(xì)胞介素10(interleukin 10,IL-10)是最初由Mosman等1989年發(fā)現(xiàn)的一種由Th2分泌的細(xì)胞因子,它能抑制Thl細(xì)胞因子的分泌。近來,越來越多的研究表明IL-10具有抑制免疫活性細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用,與移植物排斥有密切關(guān)系,因此在器官移植領(lǐng)域,越來越多的研究表明,IL-10能通過多種途徑來抑制或減輕排斥反應(yīng),從而延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間。我們通過構(gòu)建hIL-10真核表達(dá)載體為今后在器官移植免疫耐受的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1外周血單核細(xì)胞的制備

取正常人新鮮抗凝血5mL與Hanks液等量混勻后,加于4mL淋巴細(xì)胞分離液上,離心收集細(xì)胞,用5mL含10%的胎牛血清1640CM培養(yǎng)液懸浮,加入25mg/L的ConA,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h。

1.2RT-PCR擴(kuò)增人IL-10基因

淋巴細(xì)胞經(jīng)ConA刺激后,用Trizol試劑按說明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為:模板RNA溶液5μL,5×RT buffer 4μL,dNTP(各10mmol/L) 混合物2μL,RNA酶抑制劑0.5μL,引物設(shè)計(jì)參照GenBank上人IL-10基因序列分別設(shè)計(jì)引物下、下游引物。上游引物:IL-10F:CCGCTCGAG CCACC ATGCACAGC TCAGCACTGCTCT,下游引物:IL-10R:CCGGAATTC TCAGTTT CGTATCTTCATTGTC。Oligo(dT) 引物1μL,AMV返轉(zhuǎn)錄酶1μL,DEPC水6.5μL。42℃保溫1h,置95℃溫育5min 使AMV逆轉(zhuǎn)錄酶失活。將此反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR。目的片段大小約540bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min,94℃變性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(100V,30min),凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.3真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hIL10的構(gòu)建

1%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收PCR產(chǎn)物,連同pIRES2 -EGFP空載體,經(jīng)Xho I和EcoR I 雙酶切后,T4 DNA 連接酶4℃過夜連接,連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化于DH5a 感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),采用HiSpeed Plasmid Midi Kit 質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)抽提質(zhì)粒,詳見說明書。

1.4真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hIL10鑒定

1.4.1限制性內(nèi)切酶酶切、電泳及片段回收取IL-10質(zhì)粒抽提產(chǎn)物用(CTCGAG CCACC ATG)和(GAATTC TCA)雙酶切,反應(yīng)體系:Xho I 1μL,EcoR I 1μL,10×K Buffer 2μL,重組質(zhì)粒(118μg/mL)5μL,滅菌雙蒸水11μL,反應(yīng)混合液混勻后置37℃酶切過夜后,1%瓊脂糖電泳(100V,30min)凝膠成像儀成像。

1.4.2PCR法鑒定hIL-10目的基因片段IL-10基因上游引物:5 ATGC ACAG CTCA GCAC TGCT CT 3,下游: 5 TCAG TTTC GTAT CTTC ATTG TC 3,預(yù)期產(chǎn)物大小為450bp。

反應(yīng)總體積25μL,反應(yīng)體系如下:10×Buffer 2.5μL,滅菌雙蒸水17.375μL, dNTP mixture(各2.5mM)2μL,上游引物(10μM)1μL,下游引物(10μM)1μL,菌液1μL,Taq(5U/μL)0.125μL,總體積25μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(100V,30min),凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.4.3測(cè)序取質(zhì)粒抽提產(chǎn)物1mL,用通用引物送博亞公司測(cè)序。

2結(jié)果

2.1hIL-10基因的PCR產(chǎn)物電泳分析

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為一條帶,對(duì)比Marker,大小同預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。

2.2重組質(zhì)粒的酶切鑒定

紫外燈下定位切取所需DNA片段凝膠條,重組質(zhì)粒pIRES2 -EGFP-hIL-10酶切后顯示2kb和540bp兩個(gè)條帶(圖2)。

2.3重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定

重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hIL-10抽提產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果(圖3),經(jīng)Genebank的序列比對(duì),兩重組目的基因序列完全正確。

2.4重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖(圖4)

2.5紫外分光光度計(jì)測(cè)定中量抽提質(zhì)粒確定濃度及純度(表1)

3討論

白細(xì)胞介素10(Interleukin10,IL-10)最初于1989年由Fiorentino等發(fā)現(xiàn),他們證明IL-10由Th2淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞合成分泌,具有抗炎和抑制多種細(xì)胞因子合成的作用,所以稱之為細(xì)胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibiting factor,CSIF)[1]。人IL-10(hIL-10)基因定位于第一號(hào)染色體上,編碼178個(gè)氨基酸,其中含18個(gè)氨基酸疏水信號(hào)序列,成熟蛋白含160個(gè)氨基酸。IL-10的生物學(xué)功能主要有IL-10能抑制抗原特異的T細(xì)胞增殖和分泌致炎細(xì)胞因子。IL-10能直接作用于T細(xì)胞上的CD28協(xié)同刺激受體,阻斷CD28酪氨酸磷酸化過程和CD28分子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路,從而有效抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受。此外,IL-10還可以通過特異的抑制T細(xì)胞IL-2的分泌而抑制T細(xì)胞的增殖[2]。IL-10這種抑制T細(xì)胞分泌IL-2,TNF-α,IFN-γ的作用可使機(jī)體的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)受到抑制。此外,IL-10通過抑制IFN-γ的產(chǎn)生抑制NK細(xì)胞的活性。它對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響也主要是抑制性的?？傊?IL-10的這些生物學(xué)活性顯示其為一種潛在的免疫增殖反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子[3-6],是一種針對(duì)同種異體器官移植的有益的細(xì)胞因子。

目前的轉(zhuǎn)基因載體主要分為病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。其中病毒載體較有效,是目前基因治療的主要手段,但病毒載體存在一些缺陷,包括安全性、免疫原性、對(duì)靶細(xì)胞有一定的毒性、非導(dǎo)向性。有限的攜帶能力,生產(chǎn)和包裝問題、成本高昂等,限制了其推廣應(yīng)用。非病毒類價(jià)格比病毒低廉且安全,較少產(chǎn)生抗原性[7]。

熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)是近年來迅速發(fā)展的一種新型細(xì)胞示蹤技術(shù),綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP) 基因片段較小,易于構(gòu)建融合蛋白,本實(shí)驗(yàn)中選用的pIRES2-EGFP表達(dá)載體,進(jìn)入靶細(xì)胞后,具有安全性好,容量大等特點(diǎn)。以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)作為報(bào)告基因,使EGFP的熒光強(qiáng)度提高了35倍,而且轉(zhuǎn)染16～24h后仍可穩(wěn)定表達(dá),由于EGFP報(bào)告基因檢測(cè)非常方便,有別其他報(bào)告基因檢測(cè)需加入底物,具有直觀、及時(shí)、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn),是其他報(bào)告基因所無法比擬的。我們首先從人外周血分離得到淋巴細(xì)胞,通過分子克隆的手段得到了人IL-10基因,并成功的構(gòu)建出帶有報(bào)告基因EGFP的pIRES2- -hIL-10真核表達(dá)載體,目的基因進(jìn)行了序列測(cè)定和相似性比對(duì),結(jié)果顯示與GeneBank基因序列完全一致。同時(shí),酶切、PCR鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建成功。這將為下一步研究IL-10在誘導(dǎo)器官移植免疫耐受中的作用奠定前期基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Fiorentino DF,Bond MW,Mosmann TR. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones[J]. J Exp Med,1989,170(6):2081-2095.

[2] 傅繼東. 白介素-10、樹突狀細(xì)胞及免疫耐受[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué):免疫學(xué)分冊(cè),2001,24(3):133-136.

[3] Steinbrink K, Graulich E, Kubsch S,et al. CD4(+) and CD8(+) anergic T cells induced by interleukin-10-treated human dendritic cells display antigen-specific suppressor activity[M]. Blood, 2002, 99(7):2468-2476.

[4] Li WM,Liu W,Gao C,et al. Antigen-specific tolerance induced by IL-10 gene modified immature dendritic cells in experimental autoimmune myocarditis in rats[J]. Chin Med J,2006,119(19):1646- 1652.

[5] Silva SR,Jacysyn JF,Macedo MS,et al. Immunosuppressive components of Ascaris suum down-regulate expression of costimulatory molecules and function of antigen-presenting cells via an IL-10-mediated mechanism[J]. Eur J Immunol,2006,36(12):3227-3237.

[6] Zhou X,Yang N,Lu L,et al. Up-regulation of IL-10 expression in dendritic cells is involved in Trichosanthin induced immunosuppression[J]. Immunol Lett,2007,110(1):74-81.

[7] Zhang Y,Sekirov L,Saravolac E,et a1. Stabilized plasmid lipid particles for regional gene therapy: formulation and transfection properties[J]. Gene Ther,1999,6:1438-1447.

(收稿日期:2009-09-11)