膠體金免疫層析法檢測谷物中的黃曲霉毒素B1

■杜兵耀 馬 晨 余 雄

（新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊830052）

霉菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，目前已知的霉菌毒素種類有400多種[1]。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是致癌性、毒性和污染頻率最強的毒素之一[2]。1987年國際癌癥中心將AFB1定為人類有足夠證據(jù)的致癌劑[3]。由于AFB1的危害大，一旦污染難以除去，且飼料原料在生產(chǎn)、收獲、儲存過程中容易受到AFB1的污染。黃志偉等[4]采集了8個飼料企業(yè)41份谷物樣品進行檢測，其中共14份谷物樣品中含有AFB1，檢出率達34.15%。伏春燕[5]對山東省87份玉米樣品進行AFB1的檢測，檢出率高達98.85%，超標率為3.45%。張秀珠[6]對全國采集的84份谷物樣品進行AFB1的檢測，檢出率高達96.4%，結(jié)果顯示谷物中普遍存在AFB1，但安全性總體良好。因此要加強對谷物中AFB1的檢測。

傳統(tǒng)的AFB1的檢測方法主要有薄層層析法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和高效液相色譜法[7-8]。上述方法對試驗條件和檢測技術(shù)有較高要求，檢測時間長，操作復(fù)雜，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。因此需要研制出快速、簡單、經(jīng)濟的檢測方法，用于谷物中AFB1的檢測。膠體金免疫層析是最快速的檢測方法之一，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。膠體金免疫層析試紙條檢測技術(shù)是以抗原或抗體作為分析的基礎(chǔ)物，利用免疫層析法對待測物進行定量分析的方法[9]。該技術(shù)特異性強、靈敏度高、操作簡單，已經(jīng)應(yīng)用于醫(yī)學、食品、環(huán)境以及農(nóng)牧業(yè)等領(lǐng)域[10]。本試驗使用膠體金免疫層析法檢測谷物中AFB1，以確定是否可以檢出AFB1超出國家限量標準的樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

高效液相色譜；數(shù)顯恒溫水浴鍋；紫外檢測器；離心機；超聲波清洗器；超純水儀；電子精密天平；粉碎機（20目篩）；試紙條孵育器。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈為色譜純；黃曲霉毒素B1（Sigma美國公司）；黃曲霉毒素B1膠體金免疫層析試紙條[中檢環(huán)貿(mào)生物技術(shù)（北京）有限公司]；樣品（采集于北京各牛場）。

1.2 試驗步驟

首先使用國家標準規(guī)定的高效液相色譜法對加標樣品進行檢測，同時檢測AFB1的質(zhì)控標準樣品，確定結(jié)果的準確性。然后使用膠體金免疫層析試紙條進行快速檢測并對比，驗證膠體金免疫層析試紙條檢測方法的可行性。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取粉碎后的谷物（細度為全部通過20目篩）樣品10.00 g于50 ml離心管中，加入20 ml 70%的甲醇，渦旋1 min，超聲20 min后，10 000 r/min離心5 min，取上清液300 μl。

1.3.2 樣品母液的配制

用甲醇溶解AFB1的標準品，用70%的甲醇-水溶液稀釋，得到100 ng/l的標準儲備液。

1.3.3 樣品加標

分別稱取10 g玉米、小麥、豆粕樣品，準確加入2 ml 100 ng/l的AFB1標準儲備液，混勻。樣品處理方法同1.3.1。

1.3.4 膠體金免疫層析法檢測及結(jié)果分析

膠體金免疫層析試紙條插入孵育器內(nèi)，將300 μl樣品加到試紙條的樣品倉內(nèi)，孵育5 min，如果出現(xiàn)任何以下一種情況（見圖1），均視為無效：①C線（質(zhì)控線）不出現(xiàn)；②T1、T2(檢測線)或者C線嚴重不均勻；③待測樣品溶液掩蓋或者模糊了T1、T2或者C線；④膠體金微粒沒有通過T1、T2或者C線。

圖1 無效的情況

1.3.5 膠體金層析法試紙條靈敏度檢測

用70%甲醇-水溶液稀釋標準儲備液，得到AFB1最終濃度分別為 1、5、10、20 ng/ml的標準溶液。用試紙條檢測的標準方法檢測，并和高效液相色譜法進行比較，判斷免疫層析膠體金試紙條的檢測靈敏度。

1.3.6 膠體金免疫層析試紙條檢測谷物樣品

將添加AFB1的谷物樣品和未添加AFB1的谷物樣品用試紙條的標準方法檢測，并和高效液相色譜法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金免疫層析試紙條靈敏度檢驗

使用70%的甲醇-水溶液為陰性對照，讀數(shù)結(jié)果為0。當加入300 μl 1 μg/l的AFB1標準溶液時，讀數(shù)結(jié)果為1，當加入300 μl 10 μg/l的AFB1標準溶液時，讀數(shù)結(jié)果為10（見表1）。表明靈敏度符合我們的要求，且所有試紙條可用于此檢測體系中AFB1的檢測。將3種加標樣品進行檢測，并和高效液相色譜對比結(jié)果基本一致（見表2），表明該試紙條可以用于飼料原料樣品中AFB1的檢測。

表1 兩種方法對AFB1標準溶液進行比較驗證

表2 不同谷物原料中加標溶液的對比驗證

2.2 膠體金免疫層析試紙條的檢測結(jié)果

打開試紙條孵育器，水平放置并保持清潔，設(shè)定溫度為45℃。待孵育器溫度達到45℃時，將試紙條平放入孵育器內(nèi)。撕開試紙條的薄膜至指示線處，分別取不同種類300 μl的樣品加到樣品室中，然后將粘箔粘回。蓋上孵育器的蓋子，孵育5 min。取出試紙條，插入讀數(shù)儀讀取結(jié)果（見表3）。

表3 不同種類的樣品檢測結(jié)果(μg/kg)

3 結(jié)論

免疫層析試紙條法檢測前處理簡單，5 min就可以定量的檢測出飼料原料中黃曲霉毒素B1的殘留值。該試紙條靈敏度高，價格便宜，穩(wěn)定性好，操作簡單，適用于現(xiàn)場大批量的快速檢測，也可以在偏遠地區(qū)廣泛的應(yīng)用，可以有效地防止黃曲霉毒素B1中毒現(xiàn)象的發(fā)生。