菜籽粕芥子堿的熱醇提取

■余 丹 鄒成義 李 斌屈 東黃小麗

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院飼料研究所，四川成都610066；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川成都611130）

隨著“低硫甙、低芥酸”的“雙低”菜籽品種的大面積推廣，芥子堿等多酚類物質(zhì)將成為菜籽粕的最主要抗?fàn)I養(yǎng)因子，在很大程度上限制其在工業(yè)飼料中的大量應(yīng)用[1-2]。但是由于對(duì)菜籽粕芥子堿制備研究較少，其標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，飼料領(lǐng)域?qū)Σ俗哑山孀訅A的部分研究是通過(guò)在飼料中直接添加菜籽粕來(lái)完成的[3]。由于菜籽粕組分復(fù)雜，添加菜籽粕的試驗(yàn)結(jié)果并不能反映芥子堿的真實(shí)效果，因此研究菜籽粕芥子堿的分離提取方法，可為準(zhǔn)確研究菜籽粕芥子堿的生理效應(yīng)提供物美價(jià)廉的試驗(yàn)樣品，還可為優(yōu)化處理和高效利用飼用菜籽粕提供理論基礎(chǔ)。目前芥子堿制備材料主要來(lái)源于白芥子等中草藥[4]，制備的基本方法主要是熱醇提取法，對(duì)提取效率要求高的可輔以微波提取法、超聲波提取法或加速溶劑萃取法等[5-7]，對(duì)產(chǎn)品純度要求高的再用柱色譜法或大孔吸附樹(shù)脂法進(jìn)行分離純化[8]。目前菜籽粕芥子堿分離提取的研究相對(duì)較少，菜籽粕芥子堿含量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)也非常缺乏。本試驗(yàn)以菜籽粕為芥子堿的主要來(lái)源，研究其芥子堿的熱醇提取方法，確定菜籽粕芥子堿提取參數(shù)，測(cè)定菜籽粕芥子堿含量并對(duì)提取效果進(jìn)行定性定量評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)將建立菜籽粕芥子堿熱醇提取方法，為進(jìn)一步開(kāi)展菜籽粕芥子堿的相關(guān)試驗(yàn)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 樣品及主要試劑

樣品：菜籽粕樣品由成都、德陽(yáng)、綿陽(yáng)、南充、達(dá)州等地市售的菜籽粕按質(zhì)量比1∶1混合而成。

主要試劑：石油醚、無(wú)水乙醇、甲醇、硫氰化鉀、濃鹽酸、濃硝酸、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉等，均為分析純；芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于成都市食品藥品檢測(cè)中心，含量99.5%。

1.2 主要試劑與儀器

粉碎機(jī)、恒溫干燥箱、控溫水浴鍋、索式提取器、球形冷凝管、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水循環(huán)真空泵、抽濾裝置、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、顯微照相系統(tǒng)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菜籽粕的熱醇提取[8]

2.1.1 菜籽粕預(yù)處理

除雜和粉碎：剔除菜籽粕中肉眼可見(jiàn)的雜物，粉碎，過(guò)60目篩，置40℃烘箱烘干至恒重。除殘油：稱取除雜粉碎后菜籽粕樣品100 g，裝入濾紙?zhí)字袎簩?shí)，浸入含石油醚的索式提取器的圓底燒瓶中，在70℃水浴中回流脫脂至恒重。

殘油含量(%)=（脫脂前菜籽粕樣品質(zhì)量-脫脂后菜籽粕樣品質(zhì)量）/脫脂前菜籽粕樣品質(zhì)量×100。

2.1.2 菜籽粕的熱醇粗提

將烘干后的脫脂菜籽粕盛裝于圓底燒瓶，按照料液比1∶26，加入甲醇∶乙醇（體積比）=3∶5的溶劑，85℃水浴，從第1滴回流液體滴下開(kāi)始計(jì)時(shí)，提取4 h。提取液用定量濾紙過(guò)濾，40℃、120 r/min真空濃縮至無(wú)醇味，得浸膏，稱重。

浸膏提取率(%)=浸膏質(zhì)量/脫脂前菜籽粕質(zhì)量×100。

2.1.3 粗提物的純化

用蒸餾水洗滌浸膏，將浸膏定容至50 ml，加入50 ml 20%KSCN溶液，置4℃冰箱48 h，析出結(jié)晶，用定量濾紙包裹抽濾干燥。將濾紙上的晶體稱重，繼續(xù)溶于40倍量(質(zhì)量/體積)95%熱乙醇中，溶液冷卻后置4℃冰箱24 h，析出的晶體再用熱乙醇重結(jié)晶，抽濾，40℃烘干，得淡黃色針狀結(jié)晶。重結(jié)晶3次后稱重。

晶體提取率（%）=晶體質(zhì)量/脫脂前菜籽粕質(zhì)量×100。

2.2 菜籽粕熱醇提取物的鑒定

2.2.1 定性檢測(cè)

顯色反應(yīng)：分別精確稱取1 mg菜籽粕熱醇提取物晶體和標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水定容至8 ml；分別吸取晶體溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液滴至白反應(yīng)板的3個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)，每孔0.2 ml，再在孔內(nèi)滴加不同液體，觀察可見(jiàn)光和紫外光下的溶液顏色變化。具體滴加方案為在第1個(gè)孔內(nèi)滴加去離子水，穩(wěn)定后再滴加HCl；在第2個(gè)孔內(nèi)滴加NaOH；在第3個(gè)孔內(nèi)滴加濃HNO3，穩(wěn)定后再滴加NaOH。

顯微鏡照相：將芥子堿硫氰酸鹽對(duì)照品和菜籽粕熱醇提取物晶體樣品標(biāo)本置于帶照相系統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡載物臺(tái)上，分別放大4倍和10倍觀察晶體結(jié)構(gòu)并拍照。

2.2.2 定量檢測(cè)

將芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品置于干燥器中干燥24 h后，精密稱取17.79 mg芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品芥子堿含量為99.5%，則芥子堿的真實(shí)質(zhì)量為17.70 mg），用甲醇定容到10 ml容量瓶中，搖勻，即得1.77 mg/ml的芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液器分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液10、30、50、70、90、110、130、150、170、190、210 μl各1份，加入碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液0.5 ml，再分別用去離子水定容至10 ml，依次配制成濃度為1.77、5.31、8.85、12.39、15.93、19.47、23.01、26.55、30.09、33.63、37.17 μg/ml的芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

準(zhǔn)確稱取浸膏2.00 mg或結(jié)晶1.00 mg，用甲醇定容至5 ml，搖勻后再吸取定容液200 μl，用去離子水定容至5 ml，在326 nm處測(cè)定吸光度。

浸膏和晶體檢測(cè)液中芥子堿濃度計(jì)算公式為：y=(ax+b)，其中：y為浸膏或晶體的濃度；a和b為常數(shù)項(xiàng)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合回歸方程得到；x為吸光度。

浸膏或晶體中芥子堿含量=芥子堿濃度×溶液體積×稀釋倍數(shù)/浸膏或晶體測(cè)試取樣質(zhì)量。溶液體積為5 ml；稀釋倍數(shù)為5/0.2=25倍；浸膏測(cè)試取樣質(zhì)量為2.00 mg，晶體測(cè)試取樣質(zhì)量為1.00 mg。

菜籽粕中芥子堿含量=晶體中芥子堿含量×晶體質(zhì)量/菜籽粕樣品質(zhì)量。菜籽粕樣品質(zhì)量為100 g。

3 結(jié)果

3.1 菜籽粕粗脂肪和熱醇提取物的含量

菜籽粕經(jīng)過(guò)4次脫脂的殘油、粗提后浸膏以及純化后晶體的結(jié)晶含量如表1所示。本試驗(yàn)測(cè)定菜籽粕樣品粗脂肪含量為7.60%，熱醇粗提后的浸膏含量為10.01%，純化后的晶體含量為2.54%。

表1 菜籽粕殘油和熱醇提取物含量

3.2 結(jié)晶物的定性檢測(cè)

3.2.1 顯色反應(yīng)

菜籽粕熱醇提取物與芥子堿硫氰酸鹽在自然光和紫外光下的顏色反應(yīng)如圖1所示。E和H的第1排孔內(nèi)為菜籽粕硫氰酸鹽提取物溶液，第2排孔內(nèi)為芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液；F和I分別為在E和H的第1～3列孔中依次加入去離子水、HCl和濃HNO3；G和J分別為在F和I的第1列和第3列孔內(nèi)再加入NaOH溶液。E、F、G為自然光下的顏色反應(yīng)結(jié)果；H、I、J為紫外光下的顏色反應(yīng)結(jié)果。菜籽粕熱醇提取物與芥子堿硫氰酸鹽溶液在自然光下呈相同的淡黃色，紫外光下出現(xiàn)黃綠色熒光；滴加去離子水后顏色不變；滴加HCl后，在自然光和紫外光下均變成無(wú)色；滴加濃HNO3后，在自然光下變?yōu)榧t棕色，在紫外光下變成黃綠色；滴加去離子水的孔內(nèi)再滴加NaOH后，在自然光下變?yōu)辄S色，在紫外光下變成黃綠色熒光，滴加濃HNO3的孔內(nèi)再滴加NaOH后，在自然光下變?yōu)殚冱S色，在紫外光下變成黃綠色熒光。

圖1 結(jié)晶物在不同條件下的顯色結(jié)果

3.2.2 顯微鏡檢測(cè)

菜籽粕晶體與芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品晶體在4倍目鏡的顯微鏡下的成像如圖2所示，在10倍目鏡的顯微鏡下的成像如圖3所示。圖2和圖3的左圖為芥子堿硫氰酸鹽晶體，右圖為菜籽粕熱醇提取物結(jié)晶。

3.3 菜籽粕熱醇提取物的定量檢測(cè)

芥子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的OD值如表2所示，經(jīng)回歸分析，其回歸關(guān)系為y=51.561x-0.009 4，R2=0.999。說(shuō)明檢測(cè)液濃度在1.77～37.17 μg/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。浸膏、晶體和菜籽粕芥子堿含量如表3所示。浸膏和晶體檢測(cè)液的OD值分別為0.272和0.368。經(jīng)計(jì)算，浸膏和晶體檢測(cè)液芥子堿濃度分別為5.46和7.32 μg/ml，則浸膏和晶體中芥子堿含量分別為68.22%和91.49%，菜籽粕的芥子堿含量為2.54%。

4 討論

圖2 菜籽粕晶體和芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品放大4倍的顯微成像

圖3 菜籽粕熱醇提取物結(jié)晶和芥子堿硫氰酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品晶體放大10倍的顯微成像

表2 不同濃度芥子堿標(biāo)準(zhǔn)溶液OD值

由本試驗(yàn)結(jié)果可知，本研究收集的菜籽粕樣品殘油的平均含量為7.60%，此結(jié)果高于中國(guó)飼料成分及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表（2014年第25版）發(fā)布的菜籽餅和菜籽粕的粗脂肪含量，出現(xiàn)這種差異的原因可能是提取方法的差異造成的。邢軍等（2012）[9]研究證實(shí)：石油醚脫脂處理不影響油菜籽中芥子堿的含量，說(shuō)明芥子堿主要存在于油菜籽的非油餅粕中，石油醚脫脂處理不會(huì)影響油菜籽的芥子堿含量。本研究也采用石油醚對(duì)菜籽粕進(jìn)行前處理，這不僅不會(huì)對(duì)芥子堿造成損失，還能除去部分脂溶性雜質(zhì)，有利于樣品后期處理。

表3 浸膏、晶體和菜籽粕芥子堿含量

菜籽粕中熱醇粗提物——浸膏含量占菜籽粕的10.01%，晶體含量達(dá)菜籽粕的2.54%。浸膏制備簡(jiǎn)單，成本低廉，省時(shí)省力，無(wú)毒無(wú)害，若替代菜籽粕用于一般的動(dòng)物試驗(yàn)研究，可大大提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但由于其還含有其它雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的組分及其含量還需進(jìn)一步檢測(cè)確定；晶體制備程序相對(duì)復(fù)雜和耗時(shí)，但可用于實(shí)驗(yàn)室的定性和一般定量研究。

芥子堿為一種季銨鹽生物堿，結(jié)晶體為針狀，易溶于水、甲醇和乙醇等極性溶劑，在326 nm處有一紫外吸收峰。芥子堿水溶液無(wú)論在酸性還是堿性溶液中，都有明顯的顏色變化。本研究中晶體在可見(jiàn)光及紫外光中不同酸堿條件下的顏色反應(yīng)具有與芥子堿標(biāo)準(zhǔn)品相同的特征反應(yīng)結(jié)果，證明本試驗(yàn)條件下分離純化的晶體主要成分就是芥子堿。從顯微照相的結(jié)果來(lái)看，芥子堿標(biāo)準(zhǔn)品主要以單晶體形式存在，晶體透明，顏色較淺；提取物晶體為多晶聚集體，晶體透明度較差，顏色略深。出現(xiàn)這種差異的原因可能在于提取物的純度不如標(biāo)準(zhǔn)品高，所含雜質(zhì)影響了晶粒結(jié)晶過(guò)程中的形狀。結(jié)晶過(guò)程中，雜質(zhì)可以通過(guò)影響晶體的成核、生長(zhǎng)、團(tuán)聚等過(guò)程改變晶體習(xí)性、粒徑及粒度分布，導(dǎo)致晶體形態(tài)或?qū)ΨQ性發(fā)生改變[10]。

芥子堿提取方法一般是采用熱醇索氏提取，有的采用微波或超聲波進(jìn)行輔助提取。林燕妮等[7]建立了白芥子中芥子堿的微波、超聲波輔助熱醇提取的最佳條件。在芥子堿提取研究方面，常用的方法有：熱醇提取、微波和超聲波輔助提取等。本研究參照何江的提取工藝——提取時(shí)間3.93 h、提取溫度85.5℃、甲醇乙醇體積比3∶5、料液比1∶26、20%KSCN溶液鹽析、40倍量(質(zhì)量/體積)的95%熱乙醇反復(fù)重結(jié)晶，成功從菜籽粕中分離提取出了芥子堿晶體。目前芥子堿含量測(cè)定的方法主要有：雷氏鹽法、四氯化鈦法[11]、熒光測(cè)定法、紫外分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]、電離質(zhì)譜法[14]、毛細(xì)管電泳法等[15]。紫外分光光度法因其成本低廉、操作簡(jiǎn)單，常用于芥子堿的快速測(cè)定。芥子堿分子中含有一個(gè)較長(zhǎng)的共扼體系，在紫外區(qū)326 nm處有一顯著吸收峰，因此可用紫外分光光度計(jì)直接測(cè)定；芥子堿在pH值＞10的溶液中顏色變黃，最大吸收波長(zhǎng)由326 nm轉(zhuǎn)變?yōu)?88 nm，據(jù)此也可采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定。在綜合現(xiàn)有報(bào)道的基礎(chǔ)上，本研究按照何江[8]的提取工藝進(jìn)行芥子堿粗提、鹽析和數(shù)次重結(jié)晶，獲得的菜籽粕芥子堿浸膏和晶體分別占菜籽粕總量的10.01%和2.54%，采用紫外分光光度法測(cè)得浸膏和晶體中芥子堿純度分別為68.22%和91.45%，即成都周邊市售菜籽粕的芥子堿平均含量約為2.32%。目前，還未見(jiàn)可以參考的芥子堿相關(guān)的提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但本研究的提取技術(shù)簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求不高，成本低廉，易于推廣應(yīng)用，所獲得的芥子堿浸膏和結(jié)晶產(chǎn)品完全能夠滿足普通試驗(yàn)研究的需要。

5 結(jié)論

① 按照提取時(shí)間4 h，提取溫度85.5℃，甲醇乙醇體積比3∶5，料液比1∶26進(jìn)行粗提，再用20%KSCN溶液鹽析和40倍量(質(zhì)量/體積)的95%熱乙醇反復(fù)重結(jié)晶的工藝，能夠有效分離提取菜籽粕中的芥子堿，該工藝流程簡(jiǎn)單、對(duì)儀器要求低，成本低廉，值得應(yīng)用推廣。

②該工藝對(duì)菜籽粕中芥子堿浸膏和晶體的提取率可分別達(dá)10.01%和2.54%，菜籽粕、浸膏和晶體中芥子堿含量分別為2.32%、68.22%和91.49%。