肺腺癌患者血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA miR155HG表達(dá)及意義

李博文，張心宇，劉 洋，劉 禹

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma,NSCLC)是嚴(yán)重威脅人類健康的腫瘤之一，據(jù)估計(jì)，全世界近四分之一的癌癥相關(guān)死亡病例由肺癌引起[1],而NSCLC又占肺癌的近85%。肺腺癌(Adenocarcinoma of lung,LUAD)是NSCLC最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型。LUAD診斷時(shí)多為晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移，往往錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)間，盡管目前對(duì)腫瘤的治療取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，LUAD的5年生存率仍只有15%左右[2-4]。因此，找到一種能夠早期診斷LUAD的生物標(biāo)志物十分必要。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)是非編碼RNA(non-coding RNA)家族中的重要一員。LncRNA是一種長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子，不能翻譯成蛋白質(zhì)。LncRNA miR155 Host Gene(LncRNA miR155HG)，又稱B細(xì)胞整合簇，位于染色體21q21上。有文獻(xiàn)報(bào)道，LncRNA miR155HG在彌漫性大B細(xì)胞瘤和原發(fā)性縱膈淋巴瘤中高表達(dá)[5]。LncRNA miR155HG促進(jìn)膠質(zhì)瘤和GBM腫瘤的生長(zhǎng)，并與大腸癌、胰腺癌、喉鱗癌相關(guān)[6-8]。這些結(jié)果表明LncRNA miR155HG在腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。血清和血漿中的循環(huán)RNA是目前分子標(biāo)記物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在對(duì)疾病的臨床篩查和監(jiān)測(cè)中有重要應(yīng)用。LncRNA在血液、尿液等體液樣本中的表達(dá)穩(wěn)定且具有組織特異性，因此我們認(rèn)為血清中LncRNA miR155HG可能成為具有早期監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生價(jià)值的分子標(biāo)志物。

LncRNA miR155HG在LUAD的發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)水平與LUAD臨床特征的相關(guān)性尚不明確。本研究利用LUAD患者的血清標(biāo)本及健康對(duì)照組血清標(biāo)本，LncRNA miR155HG的表達(dá)水平利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative realtime PCR,RT-qPCR)方法檢測(cè)，旨在明確LncRNA miR155HG在LUAD患者的血清中的表達(dá)差異性，探討其表達(dá)水平與LUAD臨床特征的相關(guān)性，評(píng)價(jià)其作為L(zhǎng)UAD生物標(biāo)志物的可能性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年1月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院呼吸科住院的NSCLC患者為研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)共納入LUAD患者38例,男24例，女14例，年齡54～70歲，平均(62.7±8.2)歲。健康對(duì)照組25例，男16例，女9例，年齡52～68歲，平均(60.3±7.9)歲。入選患者的臨床診斷通過(guò)CT引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺活檢或手術(shù)切除獲得組織標(biāo)本進(jìn)行的。病理學(xué)檢查完成。組織學(xué)分類根據(jù)WHO 2010版標(biāo)準(zhǔn)。入選病例排除其他腫瘤、變態(tài)反應(yīng)性疾病、感染性疾病等影響。兩組一般資料比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核后進(jìn)行。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑：Tizol試劑購(gòu)自天根生化科技公司,引物購(gòu)自上海生工生物公司,Premix Ex TaqTM試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自大連寶生生物工程公司,羅氏實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀Lightcycler 480R(Software 1.5)。

1.2.2 血清樣本采集：清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，采集受試對(duì)象靜脈血4 ml,放于無(wú)抗凝劑的標(biāo)本采集管中。在室溫(20～25 ℃)放置60 min后,3000 r/min離心10 min后,分離血清1 ml至EP管中,12000 r/min離心10 min后,留取上清800 μl于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-qPCR法測(cè)定血清中LncRNA表達(dá)：利用Trizol試劑快速提取法提取血清中總RNA，并用核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA含量。取2 μg經(jīng)DNA酶處理后,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,合成的cDNA存于-20 ℃冰箱備用。反應(yīng)體系共20 μl包括：cDNA 2μl，Taq酶10 μl，上下游引物各0.5 μl，EvaGreen 1 μl ，ddH20 6 μl，將上述混合物渦旋振蕩，充分混勻。RT-qPCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s預(yù)變性,95 ℃ 5 s,63 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)。96孔板進(jìn)行樣本篩選,每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在羅氏實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀Lightcycler480R上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后利用 Software 1.5對(duì)結(jié)果進(jìn)行CT值分析，以GAPDH作為內(nèi)參按照2-ΔΔCT算法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量分析。所有實(shí)驗(yàn)引物均由Primer Blast 網(wǎng)站設(shè)計(jì)。LncRNA miR155HG的正義鏈引物序列為5’-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3’，反義鏈引物序列為5’-AGGTTGAACATC

C-CAGTGACC-3’。 GAPDH的正義鏈引物序列為5’-ATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3’，反義鏈引物序列為5’-TGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3’。RT-qPCR反應(yīng)特異性由熔解曲線判斷，若呈單峰則特異。

1.2.4 隨訪：所有患者自在醫(yī)院接受手術(shù)治療出院后開始進(jìn)行隨訪，隨訪采用電話以及復(fù)查方式進(jìn)行，隨訪截至2018年12月。本研究將整體生存期(OS) 定義為接受手術(shù)時(shí)間到死亡時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 LUAD患者血清LncRNA miR155HG的表達(dá)水平 我們通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)LncRNA miR155HG在LUAD患者血清和健康對(duì)照組血清中的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參按照2-ΔΔCT算法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量分析。比較發(fā)現(xiàn)，LncRNA miR155HG在LUAD患者血清中表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見(jiàn)圖1。

2.2 LncRNA miR155HG表達(dá)水平與LUAD臨床特征相關(guān)性 LncRNA miR155HG表達(dá)水平與LUAD臨床特征，如性別、年齡、腫瘤直徑，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等均無(wú)相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 LncRNA miR155HG表達(dá)水平與LUAD臨床特征相關(guān)性(例)

2.3 LncRNA miR155HG作為L(zhǎng)UAD診斷的分子標(biāo)志物 用ROC曲線對(duì)LncRNA miR155HG用于LUAD診斷的效能進(jìn)行評(píng)價(jià)，見(jiàn)圖2 。ROC 曲線下面積(AUC) 為0.8105(P<0.0001) 。LncRNA miR155HG診斷LUAD的敏感度及特異度分別為91.56%、70.55%。LncRNA miR155HG可以作為L(zhǎng)UAD診斷的分子標(biāo)志物。

圖2 LncRNA miR155HG診斷LUAD的ROC 曲線

2.4 LncRNA miR155HG不能作為預(yù)測(cè)LUAD預(yù)后的分子標(biāo)志物 在完成隨訪的38例LUAD患者中，以LncRNA miR155HG表達(dá)水平(2-ΔΔCT) 的均數(shù)(mean) 為截?cái)嘀?高于6.85者為低表達(dá)組(21例)，低于6.85者為高表達(dá)組(21例)。LncRNA miR155HG高表達(dá)者預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。LncRNA miR155HG不能作為預(yù)測(cè)LUAD預(yù)后的分子標(biāo)志物。見(jiàn)圖3。

圖3 LncRNA miR155HG表達(dá)水平與LUAD預(yù)后的相關(guān)性

3 討 論

本研究利用人血清標(biāo)本，探討了LncRNA miR155HG在LUAD患者血清和健康對(duì)照組血清中的差異表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與LUAD患者臨床特征的相關(guān)性，并評(píng)價(jià)其作為L(zhǎng)UAD診斷生物標(biāo)志物的可能性。本研究對(duì)于了解LncRNA miR155HG在LUAD發(fā)生中的作用及為L(zhǎng)UAD的早期診斷提供了新的線索和依據(jù)。

LncRNA最初被認(rèn)為是RNA聚合酶 Ⅱ 轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，沒(méi)有生物功能。然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明LncRNA具有多種生物功能。比如已知的LncRNA具有異質(zhì)性，可以介導(dǎo)表觀遺傳變化，招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物到特定的基因組位點(diǎn)，從而改變啟動(dòng)子在基因組的染色質(zhì)狀態(tài)，影響基因表達(dá)。LncRNA的另一重要機(jī)制是調(diào)控轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄因子或其他蛋白成分的相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄。LncRNA可能隔離在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子，防止其移位到細(xì)胞核。另外，LncRNA還具備調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的功能，對(duì)RNA的誘導(dǎo)作用，對(duì)microRNA的涂抹作用，組成RNP，抑制mRNA翻譯，調(diào)控剪接和降解mRNA的功能[9-10]。

盡管LncRNA的生物功能還未完全已知，LncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后甚至轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到關(guān)鍵作用越來(lái)越被人們重視。比如LncRNA HOTAIR，一個(gè)位于12q13上HOXC位點(diǎn)上的LncRNA，起初認(rèn)為在人類乳腺癌中具有基本作用。它通過(guò)與PRC2結(jié)合，使HOXC部分位點(diǎn)沉默，從而誘導(dǎo)H3-賴氨酸27-三甲化，進(jìn)而像胚胎成纖維細(xì)胞那樣重塑乳腺上皮細(xì)胞的基因表達(dá)模式[11]。然而有研究指出LncRNA HOTAIR在非小細(xì)胞肺癌中高水平異常表達(dá),能夠提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移與侵襲水平,可能和患者的不良預(yù)后有聯(lián)系[12]。這表明LncRNA 具有非特異性。LncRNA XIST通過(guò)調(diào)控miR-186-5p促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖[13]。LncRNA HULC最初在肝癌組織中發(fā)現(xiàn)表達(dá)失調(diào)。近來(lái)有文獻(xiàn)表明LncRNA HULC在NSCLC組織中有明顯的高表達(dá)，這與LncRNA HULC在蛋白酪氨酸磷酸酶受體O(PTPRO)中具有負(fù)向作用有關(guān)[14]。另有文獻(xiàn)表明，抑制LncRNA HULC的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。在細(xì)胞代謝過(guò)程中，LncRNA ANRIL可以與CBX7蛋白相互作用，形成PRC1多克隆蛋白復(fù)合物的一部分，從而參與前列腺癌的發(fā)生[16]。LncRNA MALAT1首先在肺癌中發(fā)現(xiàn)，后有研究顯示其調(diào)控ULK1 依賴性自噬的發(fā)生是由miR-558參與介導(dǎo)，從而保護(hù)心肌細(xì)胞并改善心臟功能[17]。

LncRNA miR155HG在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中具有致癌基因活性[18]。在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，轉(zhuǎn)錄因子MYB激活LncRNA miR155HG的活性，導(dǎo)致LncRNA miR155HG的表觀遺傳性狀改變從而引起其異常升高[19]。LncRNA miR155HG在免疫應(yīng)答機(jī)制中發(fā)揮重要作用，參與多種免疫特異性轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道，LncRNA miR155HG在多種腫瘤，如UAD、膽管癌、皮膚黑色素瘤、乳腺癌、腎細(xì)胞瘤等中的表達(dá)水平和腫瘤純度、免疫細(xì)胞如B淋巴細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞有關(guān)[20]。在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)展中，LncRNA miR155HG調(diào)節(jié)M1/M2巨噬細(xì)胞極化[21]。LncRNA miR155HG在甲型流感病毒感染期間參與調(diào)節(jié)宿主先天免疫功能[22]。

在本組研究中，LncRNA miR155HG在LUAD患者血清中的表達(dá)高于健康對(duì)照組血清表達(dá)情況。有文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA miR155HG在LUAD組織和癌旁組織的對(duì)比中有高表達(dá)，間接支持了我們的結(jié)果[23]。分析LncRNA miR155HG與LUAD臨床特征相關(guān)性時(shí)，結(jié)果顯示LncRNA miR155HG表達(dá)水平與LUAD患者的臨床特征無(wú)關(guān)，如性別、年齡、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移情況等。

我們分析ROC曲線的結(jié)果表明,LncRNA miR155HG作為生物標(biāo)志物診斷LUAD時(shí)，其曲線下面積、靈敏度及特異度分別為0.8105，91.56%、70.55%。研究結(jié)果提示LncRNA miR155HG可能與LUAD的發(fā)生過(guò)程有關(guān)，且具有作為L(zhǎng)UAD診斷生物標(biāo)志物的可能性，這將為L(zhǎng)UAD的早期診斷帶來(lái)新的方向。

LncRNA miR155HG與LUAD患者生存狀態(tài)相關(guān)性方面，據(jù)Peng等[22]的研究表明在LUAD中高表達(dá)組的患者OS長(zhǎng)于低表達(dá)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明LncRNA miR155HG與LUAD預(yù)后相關(guān)。然而在本組研究中LncRNA miR155HG高表達(dá)組OS雖然長(zhǎng)于低表達(dá)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即LncRNA miR155HG與LUAD預(yù)后無(wú)關(guān)。產(chǎn)生兩種結(jié)果不一致的原因，一方面可能由于兩組研究的樣本類型不同。另一方面也可能由于隨訪時(shí)間及樣本例數(shù)的限制。隨著未來(lái)隨訪時(shí)間的延長(zhǎng)及研究相關(guān)病例數(shù)的擴(kuò)大，LncRNA miR155HG表達(dá)水平與LUAD患者OS之間可能會(huì)出現(xiàn)相關(guān)性，但目前的研究結(jié)果仍然提示LncRNA miR155HG與LUAD的預(yù)后無(wú)關(guān)。

最近幾年，有報(bào)道稱血漿和血清中LncRNA可作為腫瘤特異性生物標(biāo)記物用于腫瘤檢測(cè)。LncRNA常形成高度穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使定量檢測(cè)體內(nèi)游離RNA成為可能。更重要的是，一些循環(huán)LncRNA已經(jīng)被證明是腫瘤診斷有價(jià)值的生物標(biāo)志物，如胃癌血漿中的H19，前列腺癌中的尿MALAT-1，這些循環(huán) LncRNA在人體體液中大量富集，可實(shí)時(shí)檢測(cè)。目前對(duì)于LUAD的常規(guī)診斷方法主要為病理檢查和血清腫瘤標(biāo)志物監(jiān)測(cè)，前者只局限于腫瘤體形成時(shí)才能檢測(cè)到，并且為有創(chuàng)檢查，對(duì)患者造成身心痛苦。而后者對(duì)腫瘤監(jiān)測(cè)的特異性和敏感性均不強(qiáng)。血清中LncRNA miR155HG不僅可以為L(zhǎng)UAD的早期診斷和治療提供新線索，還具有無(wú)創(chuàng)便捷的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究首次在LUAD患者血清中檢測(cè)LncRNA miR155HG,并對(duì)其作為L(zhǎng)UAD生物標(biāo)志物的價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究顯示，血清中LncRNA miR155HG具有作為L(zhǎng)UAD分子標(biāo)志物的可能性，對(duì)其相關(guān)機(jī)制尚需要后續(xù)深入研究。