構(gòu)建組織工程化耳廓軟骨修復(fù)體

張 路 綜述 周廣東 曹誼林 審校

因先天性小耳畸形、外傷、腫瘤造成的外耳缺損或缺失在臨床中較為常見。目前治療的手段主要是采用切取的自體肋軟骨，并對其雕刻成型重建患耳[1-2]。但其不同程度的存在耳廓造型不一，供區(qū)繼發(fā)缺損等問題。組織工程技術(shù)[3]的出現(xiàn)無疑為無（微）創(chuàng)修殘補(bǔ)缺提供了可能。目前的軟骨組織工程技術(shù)主要是利用自體軟骨細(xì)胞或成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，接種在具有三維多孔結(jié)構(gòu)的可降解支架上，通過特定的培養(yǎng)構(gòu)建方法，最終形成軟骨組織以修復(fù)缺損。

1目前已有的報(bào)道：

目前PUBMED上可以檢索到構(gòu)建組織工程化耳廓軟骨修復(fù)體的相關(guān)文獻(xiàn)共9篇[4-12]（從1997年～2007年），按照發(fā)表時(shí)間，期刊名稱、作者、實(shí)驗(yàn)所用組織工程支架材料、種子細(xì)胞、耳廓形態(tài)和構(gòu)建方法等順序總結(jié)如表1。

2存在的問題

2.1 種子細(xì)胞：以上文獻(xiàn)所用的種子細(xì)胞均為自體或異體軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞是組織工程軟骨研究最早，也最常采用的種子細(xì)胞來源。但從機(jī)體自身軟骨組織獲取細(xì)胞，一方面會造成供區(qū)繼發(fā)軟骨缺損，另一方面從供體組織獲取的軟骨細(xì)胞的增殖能力有限，容易在體外培養(yǎng)擴(kuò)增的過程中出現(xiàn)去分化現(xiàn)象[13-14]，失去軟骨細(xì)胞表型，所以不能滿足大體積組織工程化軟骨形成的細(xì)胞數(shù)量要求。目前認(rèn)為較有臨床應(yīng)用前景和可行性的組織工程軟骨種子細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），這些MSCs取材創(chuàng)傷小，增殖力強(qiáng)，能被定向誘導(dǎo)為軟骨表型細(xì)胞[15-18]，有望解決軟骨組織工程種子細(xì)胞來源不足的難題。

2.2 支架材料：以上文獻(xiàn)所采用的支架材料分為兩類，一類是當(dāng)前組織工程支架材料方面最常選用的聚羥基乙酸及其類似纖維合成聚合物，因其具有良好的生物相容性和生物可降解性，并已充分證實(shí)了其與軟骨細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建成熟軟骨組織的穩(wěn)定效果[19-20]。但是，要將棉絮樣的無紡聚羥基乙酸纖維加工預(yù)塑形成精確的耳廓形態(tài)一直是一大難題。另一類是凝膠狀支架材料，如Pluronic F-127，纖維蛋白膠等，復(fù)合細(xì)胞后是修補(bǔ)小面積不規(guī)則缺損的理想支架材料，但作為具有特定形態(tài)的大器官構(gòu)建（如耳廓，氣管，外鼻軟骨等）用還存在塑形困難及力學(xué)強(qiáng)度不足等問題。同時(shí)，使用該類支架不利于體外構(gòu)建。

2.3 組織構(gòu)建：目前已有的報(bào)道多集中于應(yīng)用軟骨細(xì)胞與手工制作的耳廓形態(tài)支架材料復(fù)合后植入免疫缺陷動物（如裸鼠）體內(nèi)構(gòu)建耳廓軟骨，但其存在取膜工藝復(fù)雜、所得耳廓軟骨產(chǎn)物由健側(cè)耳所得、外型不佳等問題，造成該修復(fù)體缺乏臨床應(yīng)用價(jià)值（尤其針對先天或后天性外耳畸形或缺損病例）。此外，細(xì)胞-支架材料復(fù)合物能否在免疫功能健全的動物體內(nèi)形成成熟的軟骨，而不至于被排斥、吸收及受壓變形有待進(jìn)一步證實(shí)。所以，建立穩(wěn)定的具有免疫功能的大動物模型是未來組織工程軟骨真正實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的必經(jīng)之路。

3臨床應(yīng)用尚需解決的問題

3.1 可塑性：組織工程化耳廓修復(fù)體要實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，首先要解決的是可塑性的問題。目前，要把生物支架材料加工成個體差異非常大的、與健側(cè)耳相對稱的耳廓修復(fù)體還是一大難題。計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(Computer Aided Design， CAD)和快速成型(Rapid Prototype， RP)技術(shù)[21-22]的出現(xiàn)無疑為這一問題的解決提供了一種可能。它能將病人的正常耳廓數(shù)據(jù)導(dǎo)入計(jì)算機(jī)并進(jìn)行個性化設(shè)計(jì)，再通過生物打印技術(shù)將組織工程用支架材料直接打印出來，從而可以直接對細(xì)胞進(jìn)行接種。此外，該支架復(fù)合細(xì)胞后所構(gòu)建的產(chǎn)物要有足夠的強(qiáng)度去對抗植入人體皮下所帶來的張力從而維持原先的形狀，這對支架材料的強(qiáng)度提出了新的要求。

3.2 修復(fù)體外露及吸收：修復(fù)體外露及吸收容易發(fā)生在早期細(xì)胞支架復(fù)合物植入過程中，由于支架尚未完全降解甚至細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)尚未充分包埋支架，容易造成機(jī)體對支架及其降解產(chǎn)物的無菌性炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞侵潤，釋放炎性因子，交界面無法愈合，從而造成修復(fù)體外露及吸收。因此，細(xì)胞支架復(fù)合物的體外預(yù)構(gòu)建十分重要，不僅可以使支架降解、細(xì)胞及其細(xì)胞外基質(zhì)充分包埋，同時(shí)也可以對植入物進(jìn)行必要的生物相容性檢測及生物力學(xué)檢測。

3.3 無法控制的細(xì)胞增殖：在應(yīng)用干細(xì)胞作為種子細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)構(gòu)建軟骨的過程中，干細(xì)胞的安全性問題一直是爭論的焦點(diǎn)。尤其是胚胎干細(xì)胞，其高度的成瘤性[23-24]將直接限制其臨床應(yīng)用。而成體干細(xì)胞被認(rèn)為無成瘤性，但目前尚缺乏體內(nèi)長期追蹤及人體臨床試驗(yàn)的安全性證據(jù)。

3.4 耳廓軟骨的性質(zhì)：耳廓軟骨是人體最大的彈性軟骨，組織學(xué)和生物力學(xué)性質(zhì)都與其它類型的軟骨（包括透明軟骨及纖維軟骨）有所不同，因其細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)含有彈性纖維。而目前所構(gòu)建的組織工程化軟骨尚無法形成含有類似正常彈力纖維的軟骨，也缺乏相關(guān)研究的報(bào)道。

3.5 供區(qū)損傷：盡管組織工程的種子細(xì)胞可以在體外不斷擴(kuò)增培養(yǎng)，但以軟骨細(xì)胞為例，因其增殖能力有限，容易在體外擴(kuò)增的過程中出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。所以取材時(shí)需要對較大的軟骨塊進(jìn)行細(xì)胞收集。排除肋軟骨取材的并發(fā)癥，肋軟骨本身細(xì)胞/基質(zhì)比很低，會造成不宜消化及所得相對細(xì)胞數(shù)較少等問題，因此不利于臨床應(yīng)用。而按照目前構(gòu)建正常耳廓所需的軟骨種子細(xì)胞數(shù)量（大約4～5×108），單純切取小塊鼻中隔軟骨及耳甲腔軟骨用以收集細(xì)胞是不能滿足要求的。而應(yīng)用成體干細(xì)胞作為種子細(xì)胞構(gòu)建軟骨，其供區(qū)損傷要相對小得多。

3.6 細(xì)胞擴(kuò)增：軟骨增殖能力有限，容易在體外擴(kuò)增的過程出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，所以目前一般用到第3代細(xì)胞已經(jīng)是極限。而成體干細(xì)胞增值能力非常強(qiáng)，可以以極低密度傳代，理論上可以獲得足夠量的細(xì)胞。但就目前的細(xì)胞培養(yǎng)條件而言，一個10cm直徑的培養(yǎng)皿平均只能容納106～107個細(xì)胞，這樣就需要耗費(fèi)大量的人力、財(cái)力和時(shí)間，因此很難實(shí)現(xiàn)臨床推廣。而目前出現(xiàn)的微載體細(xì)胞培養(yǎng)方法[25-28]大大提高了細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的效率，有望解決細(xì)胞擴(kuò)增的問題。

3.7 可能出現(xiàn)的倫理學(xué)問題：雖然醫(yī)生們對干細(xì)胞技術(shù)及其應(yīng)用持歡迎態(tài)度，但目前還是有很多國家法律立法限制其研究，尤其是針對胚胎干細(xì)胞。因?yàn)樗艽蟪潭壬吓c生命的起源相關(guān)聯(lián)。

4總結(jié)

近10年來，組織工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域都取得了長足的進(jìn)步，其中組織工程化耳廓軟骨是幾個比較具有實(shí)踐性和應(yīng)用性的組織工程產(chǎn)品之一，它是組織工程基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化的必然過程，雖然還有不少問題有待解決。但筆者相信，隨著我國863、973等重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目對組織工程進(jìn)行立項(xiàng)，以及國內(nèi)外組織工程研究熱潮的興起，新技術(shù)、新材料、新發(fā)明的不斷涌現(xiàn)，不久的將來可以看到類似于組織工程化耳廓軟骨等相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)用于整形外科乃至整個醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域。

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[收稿日期]2008-07-25[修回日期]2008-09-27

編輯/張惠娟