脂肪干細胞在皮下軟組織充填中的研究進展

洪曉婭 綜述，徐靖宏 審校

[摘要]脂肪干細胞(Adipose-Derived Stem CellsADSCs)具有一般干細胞的特點，即多向分化潛能和穩(wěn)定的體外多代增殖能力，其免疫相容性好，來源豐富，易于獲得，可反復取材，無倫理學問題，作為組織工程的種子細胞有著非常重要的實際研究和應用價值。本文著重對脂肪干細胞在生物學特性、體外成脂誘導分化，以及與之相配的生物學載體支架方面的最新進展進行闡述。

[關鍵詞]脂肪干細胞；誘導分化；載體支架

[中圖分類號]R622[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2008）10-1540-03

Application of adipose tissue-derived stem cells in subcutaneous soft tissue filling

HONG Xiao-ya，XU Jing-hong

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital，College of Medicine，

Zhejiang University，Hangzhou 310003，Zhejiang，China）

Abstract: Adipose tissue is an abundant， accessible， and replenishable source of adult stem cells. Adipose-derived stem cells(ADSCs) can be isolated from liposuction waste tissue by collagenase digestion and differential centrifugation. They are multipotent， differentiating along the adipocyte， chondrocyte， myocyte， neuronal， and osteoblast lineages. ADSCs cells have potential applications for the filling of subcutaneous soft tissue. Additional pre-clinical safety and efficacy studies will be needed before the promise of these cells can be fully realized.

Key words:ADSCs; differentiate;support

皮下軟組織充填一直是整形外科常見的治療手段，對于體表的皮下軟組織欠豐滿、凹陷、萎縮畸形目前常采用自體游離脂肪或各種人工材料進行充填。人工材料因存在排異、創(chuàng)傷大及安全性等問題難以滿足臨床需要，而自體游離脂肪的移植成活率僅為40%～50%，這使得其臨床應用受到很大限制。脂肪移植物被吸收的原因之一是成熟脂肪細胞對缺氧、損傷的耐受力低，且不能增殖更新[1]。而脂肪干細胞（ADSCs）則具有強大的增殖分化潛力，對缺氧耐受力更強，且自體干細胞用于移植可避免排異反應，更加安全。2001年Zuk[2]等從脂肪細胞抽吸物中成功分離培養(yǎng)出具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細胞，cronthos[3]等于同年也證實脂肪來源細胞中的確存在具有間充質(zhì)干細胞特性的細胞。2002年Zuk[4]等又證實了人的脂肪組織是多能干細胞的一個來源，具有分化為所有中胚層起源細胞的能力，還可分化為部分內(nèi)外胚層起源的細胞，自此脂肪干細胞(ASCs)以其來源豐富、易于獲得、能在體外多代穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能、免疫相容性好、取材對患者損傷小等優(yōu)點而日益成為研究熱點?，F(xiàn)將其成脂誘導及誘導后復合生物支架材料用于軟組織填充修復研究現(xiàn)狀綜述如下。

1取材、提取、體外擴增

取材部位最好能配合患者身體塑形的需要，做到一舉兩得。平均每300ml脂肪組織可獲得2×lO8～6×l08個干細胞，從不同個體的脂肪抽吸組織中提取的平均脂肪干細胞數(shù)目有所不同，但從同一個體不同部位的脂肪中所獲得的干細胞數(shù)目卻比較近似?；颊吣挲g越大，成脂分化率越低，同一患者不同部位來源的脂肪抽吸組織中的脂肪干細胞在成脂誘導分化能力上存在差異[5]。

目前常采用電動負壓吸脂術或注射器手工抽脂術獲取無菌脂肪組織，一般認為注射器手工抽取的脂肪損傷較小。利用分層純化法將脂肪混合物靜置片刻，分別去除上下兩層。將獲得的脂肪用PBS緩沖液洗4次，以去除紅細胞和細胞碎片。清洗后用適量的0.075%膠原酶Ⅰ在振動器37℃下消化1h。膠原酶Ⅰ活性用等量DMEM(含10%的胎牛血清)中和，后離心1200轉(zhuǎn)(10min)，細胞即被懸浮在DMEM中，用100目篩網(wǎng)過濾，離心10min以沉淀細胞，重新懸浮細胞加至培養(yǎng)瓶，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)液將未貼壁細胞和殘渣被除掉。后每周換液2次，達到對數(shù)生長期后，用0.25胰酶37℃消化，按1:3的比例進行傳代。體外擴增10代，平均每代倍增數(shù)目為1.59±0.224，累計倍增數(shù)目為15.53[6]。消化所得細胞除用于延續(xù)培養(yǎng)和進行相關實驗外，其余可按照一般方法凍存。凍存后6個月內(nèi)，以37℃水浴快速復蘇細胞，接種于培養(yǎng)皿中可繼續(xù)傳代擴增。

脂肪干細胞至少能保持20代的傳代活性，且細胞倍增時間與年齡呈正相關，即年輕人較年老者的脂肪干細胞具有更強的增殖能力[7]。自分泌成纖維細胞生長因子2（FGF-2）對于人體脂肪干細胞的自我增殖具有關鍵性意義[8]。脂肪干細胞在體外的倍增時間按照培養(yǎng)基的類型和傳代數(shù)目的不同大致為2～4天[9]，且在傳代中保持其端粒酶的長度[10]。但也有報道稱端粒酶在遞進式傳代過程中會逐漸失去活性并縮短[11]。此類研究涉及ASCs移植的安全性問題，有報道稱觀測到人類ASCs在經(jīng)歷長期傳代（>4個月）后發(fā)生惡變[12]。提示對于ASCs移植必須建立一套嚴格的安全性檢測體系，其中應包含染色體組型測定。

2ASCs生物學特性

從肉眼上脂肪組織可被區(qū)分為，骨髓內(nèi)脂肪、棕色脂肪、乳房脂肪、機械充填脂肪、白色脂肪等至少5種類型。每種脂肪各自具有不同的生物學特性及功能。因各類脂肪皆有內(nèi)分泌功能可分泌瘦素、抵抗素等激素參與全身生理調(diào)節(jié)，脂肪組織做為整體目前傾向于被認為是一個內(nèi)分泌器官。從人脂肪組織中提取的ASCs，以DMEM培養(yǎng)，流式細胞儀檢測表面抗原，以集落形成能力和群體倍增時間來評估增殖潛力，油紅0染色來觀察ASCs經(jīng)成脂誘導后中性脂類的蓄積，發(fā)現(xiàn)ASCs表達CD44、CD73、CD90、CD105，不表達 CD14、CD31、CD45，具有很高的增殖潛力和多向分化潛能，且良好的免疫相容性類似于BMSCs[13]。中性脂肪干細胞形態(tài)以梭形為主，CD11b、CD45、CD49d、CD80、CD86表達陰性，MHC I、MHC lI表達弱陽性，CD29、CD44、CD54的表達陽性。第l1代以前的脂肪干細胞有較強的活力和增殖能力，體外培養(yǎng)至第10代，其細胞仍穩(wěn)定為二倍體核型BrdU可標記其核。說明ASCs具有較強的自我更新能力，其形態(tài)和表面標志均類似于BMSCs[14]?；诹魇郊毎麅x分析和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應研究，發(fā)現(xiàn)hADAS細胞不表達一些其它干細胞群表達的蛋白質(zhì)，包括端粒末端轉(zhuǎn)移酶、CD133、膜轉(zhuǎn)運ABCG2[15]。另有研究對三種來源（骨髓、臍血、脂肪組織）的干細胞在分離成功率、增殖能力、分化潛力、免疫表型等方面進行比較，發(fā)現(xiàn)三種來源的干細胞在組織形態(tài)和免疫表型上無顯著差異，而在其他生物學特性方面差異明顯，如脂肪來源的干細胞增殖能力明顯強于另外兩者，臍血來源干細胞增殖能力最弱且不具備向脂肪組織分化能力 [16]。相關研究還表明ASCs較BMSCs具有更好的遺傳穩(wěn)定性[17]。

3體外誘導分化

ASCs具有多向分化潛能，不僅能分化為中胚層細胞，如脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞，還能分化為外胚層及內(nèi)胚層細胞，如神經(jīng)細胞、肝細胞等。目前尚無標準誘導方案，也都未能得到成熟細胞。由于脂肪組織常用于皮下軟組織充填，故將成脂誘導情況總結如下：

成脂誘導培養(yǎng)基1：高糖(含25 mmol/L D-葡萄糖)－DMEM、10%FBS（胎牛血清）、1μmol/L地塞米松、100μmol/L IBMX（異丁甲基黃嘌呤）、5μmol/L胰島素和60μmol/L吲哚美辛。

成脂誘導培養(yǎng)基2：高糖-DMEM、10%FBS、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、10μmol/L胰島素、200μmol/L吲哚美辛、100U/ml鏈霉素、100U/ml青霉素。

成脂誘導培養(yǎng)基3：高糖－DMEM、10%胎牛血清、0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、10μmol/L胰島素、1%青鏈霉素原液。

各方案大同小異，經(jīng)2周的誘導后，用油紅染色鑒定細胞內(nèi)皆有脂滴聚集，但都未能得到成熟脂肪細胞。如果同時用DMEM/MCDB培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)較α-MEM培養(yǎng)基更有利于細胞的增殖和分化[18]。過氧化物酶增殖物活化受體和C/EBP家族，兩者是控制脂肪細胞分化的中心環(huán)節(jié)[19]。

一般而言，利用脂肪干細胞充填皮下軟組織，實驗設計皆為在體外用以上培養(yǎng)基誘導至一定階段后再復合支架材料植入體內(nèi)，細胞移植成功率為50%～80%不等。因其移植成活率較低且不穩(wěn)定，尚未達到臨床應用要求水平，有學者設想可在體外模擬體內(nèi)微環(huán)境誘導干細胞進一步分化成熟從而提高移植存活率。也有意見認為分離得到的干細胞無需體外誘導，直接復合支架植入體內(nèi)，體內(nèi)的微環(huán)境即可自行確定分化方向并可能以此提高移植細胞存活率，以上觀點均需進一步的實驗驗證。

4載體支架材料

組織工程技術主要包括生物材料載體、種子細胞及訊息因子。理想的生物載體材料應具有良好的生物相容性，對細胞和組織等無毒性，能以適當速度被吸收降解，強度適中，利于細胞生長和周圍組織長入。因不同材料對細胞的生長分化和黏附均有不同的影響，不同的細胞對支架的要求也不盡相同，因而種子細胞能否在支架材料上良好生長并表達自身特異性功能取決于二者的適配程度。

理論上講，可用于復合脂肪干細胞的生物支架按材料分為三大類：①天然生物材料，如膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等，此類材料以仿生原理模擬細胞外基質(zhì)組成；②合成生物材料，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚（乳酸－乙醇酸）共聚體等，此類材料具有的優(yōu)勢為可控的降解性；③復合生物材料，為兩種或多種天然生物材料或（與）合成生物材料復合而成，具有仿生及可控性的多元優(yōu)勢。按支架的構建方式可分為：三維多孔支架，如PLA多孔支架、膠原/殼聚糖多孔支架，可廣泛應用于多種細胞及干細胞的復合移植；凝膠填充支架，如水凝膠填充支架，可用于軟骨等的修復；薄膜支架，多用于血管的修復重建；微粒支架，如PLLA微粒支架等。對于支架的生物相容性研究，也經(jīng)歷了生物惰性材料、可調(diào)控細胞行為功能的生物活性可吸收材料、具有激活機體再生潛能的組織誘導型生物材料等發(fā)展階段。

目前脂肪干細胞復合支架移植仍處于動物實驗階段，移植后細胞生長變化過程及相關影響因素尚不十分清楚，所用材料主要以天然生物材料為主，與新型組織誘導型材料復合的研究較少，移植存活率不同實驗結果相差很大，其最適材料仍有待于進一步研究與選擇。

有研究者將ADSc與海綿狀透明質(zhì)酸支架材料復合，經(jīng)體外成脂誘導后有脂質(zhì)蓄積，檢測到脂肪形成的標志酶甘油-3-磷酸脫氫酶[20]。Stosich[21]等將誘導得到的脂肪細胞分為6組，每組6份樣品，第一組將細胞植入圓柱形水凝膠，外層用乙烯－乙二醇多聚體包裹；第二組只將細胞植入水凝膠；第三組將細胞植入多孔膠原海綿；第四組單用無細胞水凝膠；第五組只用細胞；第六組只用無細胞膠原海綿。將六組全部植入無胸腺小鼠4周，結果所有有支架的組都有實質(zhì)脂肪組織生成，其中第一組效果最好，保有量最高，幾乎100%的細胞量次被保留，而第二組的細胞量次保留程度只有35%～65%，證明了預先定形的支架可最大限度地維護植入細胞的存活數(shù)量。

5需解決的問題

關于脂肪干細胞的應用，目前仍有許多重要問題有待探索、解決。首先脂肪干細胞在無免疫力的移植受體上表現(xiàn)出的腫瘤樣無限增生特性，在進入臨床實驗前仍需尋找并建立合適的動物模型進行長期觀測以確定其移植后安全性。其次，在批量提取生產(chǎn)脂肪干細胞的過程中，如何保障細胞質(zhì)量的均一穩(wěn)定仍然有待進一步研究。

綜上所述，ASCs具有來源豐富、易于獲得、具有多向分化潛能、免疫相容性好、可反復取材、對患者損傷小等優(yōu)點，相較BMSCs具有更加強大的體外多代增殖能力，相較胚胎干細胞而言可避開倫理學問題。取材時可結合美容塑形的要求取得一舉兩得的效果。因此是可利用的種子細胞，有望在一定條件下，定向誘導分化為脂肪細胞，提高自體脂肪移植存活率，達到臨床治療目的。

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[收稿日期]2008-07-11[修回日期]2008-10-08

編輯/張惠娟