經(jīng)ＲＮＡｉ誘導(dǎo)的前脂肪細(xì)胞構(gòu)建組織工程化脂肪組織

[摘要]目的：應(yīng)用基因工程和組織工程的原理和方法，通過(guò)改造人前體脂肪細(xì)胞，提高其活性后，于裸鼠背部皮下構(gòu)建組織工程化脂肪組織。方法：采用原代消化細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)出前脂肪細(xì)胞，利用RNAi技術(shù)，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要凋亡調(diào)控基因Bax基因表達(dá)沉默，然后接種到聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架上，種植在20只雌性裸鼠皮下，對(duì)獲得的脂肪組織進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果：經(jīng)過(guò)改造后的前脂肪細(xì)胞活性良好，術(shù)后裸鼠全部成活，前脂肪細(xì)胞能夠在支架上良好的存活，生長(zhǎng)和增殖。結(jié)論：經(jīng)過(guò)改造后的前脂肪細(xì)胞具有良好的活性，并且PLGA- 前脂肪細(xì)胞復(fù)合體在裸鼠體內(nèi)可形成脂肪細(xì)胞，值得進(jìn)一步研究， 以探索治療軟組織缺損的新途徑。

[關(guān)鍵詞]RNAi；Bax基因；組織工程；脂肪組織

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2008）10-1479-04

RNAi induced preadipocytes to build tissue engineering adipose tissue

ZHUANG Jian-hua1，ZHUO Yang2，ZENG Xing-ye2

(1.Department of Surgery， Lucheng People's Hospital， Wenzhou 325000，Zhejiang，China;

2.Department of Surgery， the 118th Hospital of PLA)

ObjectiveUsing genetic engineering and tissue engineering principles and methods， through the transformation of preadipocytes， enhancing its activity，and to construct tissue engineering adipose tissue in the back skin of nude mice.Methods Using primary-digest method to culture preadipocytes， using RNAi technology to induct an important apoptosis gene Bax gene expression silence in preadipocytes，and then inoculated into polylactic acid - glycolic acid copolymer (PLGA) scaffold ， planted in 20 female nude mice， the adipose tissue was carried out histological evaluation. Results After ransformation， the activity of preadipocytes is good， after all the mice survived. preadipocytes can survive well in the scaffold， growing and proliferation.ConclusionsAfter ransformation， preadipocytes has good activity， and PLGA- preadipocytes can be formed fat cells in nude mice， it is worth further study to explore the treatment of soft tissue defects in new ways.

Key words：RNAi；Bax gene；tissue engineering；adipose tissue

自體脂肪組織是修復(fù)各類(lèi)組織缺損的最佳填充物，但體內(nèi)脂肪組織一旦離開(kāi)活體常易出現(xiàn)變性、壞死，如何獲取活性脂肪細(xì)胞，是脂肪組織移植成功的關(guān)鍵。前脂肪細(xì)胞是一類(lèi)能夠增殖并向脂肪細(xì)胞分化的特異性前體細(xì)胞，為構(gòu)建組織工程化脂肪組織的理想種子細(xì)胞。本研究從人體脂肪組織中提取人前脂肪細(xì)胞作為種子細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，利用RNAi技術(shù)，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要的凋亡調(diào)控基因Bax基因表達(dá)沉默，以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，抑制其凋亡，經(jīng)上述處理的前脂肪細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)后，再和可降解人工細(xì)胞外基質(zhì)（PLGA）混合培養(yǎng)，于裸鼠背部皮下體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織，以探索治療軟組織缺損的新的途徑。

1材料和方法

1.1可吸收性支架材料：研究采用的可吸收支架材料為PLGA材料，其主要技術(shù)參數(shù)為：PLA與PGA共聚物，兩者單體的摩爾比為50:50，完全降解時(shí)間6～12個(gè)月，泡沫孔隙率為85%以上，孔徑200～300μm。

1.2裸鼠及脂肪組織的來(lái)源

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用 BALB/C純合雌性裸鼠20只，鼠齡 6～8周，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物存放在預(yù)先消毒的微隔離器里，再置于隔離室的層流通風(fēng)窗內(nèi)。裸鼠1鼠1籠放置 ，用消毒的專(zhuān)用飼料和水喂養(yǎng)。

1.2.2選取于本院行切疤植皮術(shù)的正常體重患者，年齡20～45歲，無(wú)其他急慢性疾病，切取腹部正常皮下脂肪組織。

1．3 方法

1.3.1 原代培養(yǎng)：術(shù)中切取皮下脂肪組織，PBS洗滌，去除脂肪組織中肉眼可見(jiàn)的纖維及血管成分，剪切約20min，使之成為約0.5～1mm3的小組織塊，以1000r/min離心10min，取上層純脂肪顆粒，加入1%膠原酶，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化15h，再以1 500r/min離心3～5min，棄去上層漂浮的脂肪細(xì)胞和培養(yǎng)液，沉積的細(xì)胞用基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打使之混合均勻，150μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾，PBS洗滌并離心，吹打均勻，接種于35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，接種密度為每平方厘米1×104～2×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)皿內(nèi)加入適量含20%胎牛血清，青、鏈霉素濃度均為100U/ml的全培，混合均勻，置于37℃，5%CO2孵箱內(nèi)孵育，每天觀察，2～3天換液。

1.3.2 細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近單層匯合1/2時(shí)即進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。以0.25%胰蛋白酶＋0.03%EDTA進(jìn)行消化，于室溫下消化約1min，在倒置顯微鏡下觀察見(jiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量培養(yǎng)基，用吸管將細(xì)胞吹打下來(lái)，按1傳2的比例進(jìn)行傳代，當(dāng)傳代細(xì)胞生長(zhǎng)接近單層匯合70%時(shí)，可繼續(xù)傳代。

1.3.3引物、siRNA模板設(shè)計(jì)及siRNA合成

1.3.3.1在GenBank中查找到人Bax基因mRNA(gi:34335114)：用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，Bax-sense:5′-gcttcagggtttcatccagg-3′，Bax-antisense:5′-tgtc cacggcggcaatca-3′，擴(kuò)增片斷176bp。同源性檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)在 GenBank中有其它同源序列。應(yīng)用Ambion公司靶點(diǎn)搜尋工具并結(jié)合RNAstructure分析結(jié)果，Bax基因mRNA抑制靶點(diǎn)選在130、131aa二聯(lián)堿基開(kāi)始的5′-gacaggggcccttttgctt-3′，在序列3'端加上T7啟動(dòng)子互補(bǔ)序列-cctgtctc，得到轉(zhuǎn)錄模板。siRNA合成遵照SilencerTMsiRNAConstructionKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3.2轉(zhuǎn)染混合物制備：用無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM稀釋siRNA和轉(zhuǎn)染試劑，并將后者緩慢滴加入前者，siRNA和轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比為1:15，混合物室溫孵育備用。

1.3.3.3實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染：待前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，換轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液2ml，36h后測(cè)Bax基因表達(dá)水平。

1.4 經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染后的前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)

將PLGA切成5mm×5mm×0.5mm正方形小塊放入培養(yǎng)皿中，分別75%酒精浸泡消毒2h， 雙抗浸泡過(guò)夜，無(wú)菌PBS浸洗3遍，然后置入90mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中干燥，用時(shí)再紫外線照射30min。實(shí)驗(yàn)分2組 ，每組20個(gè)標(biāo)本，Ⅰ組(實(shí)驗(yàn)組): 將20個(gè)標(biāo)本置于24孔培養(yǎng)板中，滴加適量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)濕過(guò)夜，以增加其親水性，取1ml經(jīng)酶消化的2×105/ml單細(xì)胞懸液置于PLGA海綿支架上，再加入2ml10%FBS DMEM培養(yǎng)液使其均勻分布；Ⅱ組（對(duì)照組）:將未接種細(xì)胞的單純支架材料滴加適量含20%FBS DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)濕過(guò)夜， 再加入2ml 10%FBS DMEM培養(yǎng)液，兩組靜置培養(yǎng)72h。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法：20只裸鼠按實(shí)驗(yàn)分組，在裸鼠背部左右兩側(cè)用75%酒精消毒，于兩肩胛骨處各作一0.5cm切口，潛行分離形成皮下腔隙，將體外培養(yǎng)的兩組支架材料共40個(gè)樣本，于每只鼠背部皮下植入2個(gè)復(fù)合體（左側(cè)為I組，右側(cè)為II組），切口用5-0絲線縫合，傷口涂酒精后裸露，術(shù)后不用任何抗生素。裸鼠轉(zhuǎn)入各自籠內(nèi)飼養(yǎng)后，每天觀察，在預(yù)定時(shí)間內(nèi)切開(kāi)背部皮膚，切取植入物，迅速置于10%甲醛或2.5%戊二醛中固定，以待進(jìn)一步處理后作光鏡或電鏡檢查。

2結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)前脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：接種后細(xì)胞在數(shù)小時(shí)后貼壁，初為類(lèi)圓形，細(xì)胞大小不等，核/漿比例較大，細(xì)胞核幾乎充滿(mǎn)胞漿。2～4天即逐漸伸展開(kāi)，大多數(shù)細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，兩端尖細(xì)，尖端可延伸很長(zhǎng)，有的細(xì)胞為多角形，立體感較強(qiáng)，胞漿內(nèi)可見(jiàn)數(shù)量不等的線粒體，核橢圓形，較大，核仁較清晰（圖1）。2～3周可形成內(nèi)含大小不等脂滴的多脂滴脂肪細(xì)胞，脂滴更可匯合形成單脂滴脂肪細(xì)胞，含脂滴細(xì)胞逐漸增多，最終可達(dá)到80%以上（圖2）。

2.2 siRNA-Bax對(duì)前脂肪細(xì)胞Bax基因表達(dá)水平的影響（圖3）：從圖中可以看出，陽(yáng)性對(duì)照組中Bax基因表達(dá)水平明顯比陰性對(duì)照組要弱，說(shuō)明siRNA-Bax對(duì)前脂肪細(xì)胞Bax基因表達(dá)水平起到了明顯的抑制作用。

2.3 培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)特性觀察：掃描電鏡觀察：PLGA材料均為珊瑚狀多孔結(jié)構(gòu)，氣孔多為連通氣孔，氣孔分布為大孔-微孔結(jié)構(gòu)，其中大孔孔徑為200～300μm，相互連通，在大孔孔壁上分布著孔徑5μm以下的微孔（圖4）。與細(xì)胞共孵育1周后，可見(jiàn)細(xì)胞呈橢圓球形或不規(guī)則形，緊密粘附于PLGA支架表面，細(xì)胞與材料及細(xì)胞間有絲狀纖維形成。

2.4移植物的生長(zhǎng)特性觀察 術(shù)后裸鼠全部成活，完成實(shí)驗(yàn)觀察。

2.4.1大體觀察：種植后傷口及種植區(qū)未見(jiàn)感染和種植物排出。第2周時(shí)，裸鼠兩肩胛區(qū)可各觸及有一皮下結(jié)節(jié)，推動(dòng)該處皮膚，結(jié)節(jié)可同時(shí)活動(dòng)，植入物同表面皮膚結(jié)合緊密，與底部肌肉組織結(jié)合疏松。切開(kāi)皮膚，見(jiàn)植入物形狀改變，左側(cè)由原來(lái)的正方塊變圓變光滑，呈“鵝卵石”樣，有包膜覆蓋，包膜上有豐富小血管網(wǎng)，主要來(lái)自裸鼠皮膚，移植物的大小同植入前無(wú)明顯差別。右側(cè)移植物同植入前無(wú)明顯差別，有包膜覆蓋，包膜上無(wú)小血管網(wǎng)。第4周時(shí)， 左側(cè)移植物體積較植入前大，右側(cè)移植物體積較植入前小，切開(kāi)皮膚，左側(cè)繼續(xù)變扁變光滑，有包膜覆蓋，來(lái)自裸鼠皮膚的血管進(jìn)入包膜 ，然后廣泛發(fā)出分枝，質(zhì)地變軟。右側(cè)開(kāi)始萎縮，表面有包膜覆蓋，包膜上無(wú)小血管網(wǎng)，質(zhì)地變軟（圖5）。

2.4.2 電鏡觀察：I組第2周，掃描電鏡可見(jiàn)前脂肪細(xì)胞在PLGA纖維上貼附生長(zhǎng)， 部分細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，伸展良好，另一部分細(xì)胞為球形，未伸展開(kāi)，另外可見(jiàn)部分小的球形細(xì)胞，可能為裸鼠的淋巴細(xì)胞。I組第4周，掃描電鏡見(jiàn)細(xì)胞呈扁平多角形或圓形，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈聚集性分布，細(xì)胞周?chē)写罅炕|(zhì)，表明前脂肪細(xì)胞在支架上粘附、伸展和生長(zhǎng)良好（圖6）。II組第4周，透射電鏡下見(jiàn)材料孔洞變大，不光滑，連續(xù)性不明顯，有崩解現(xiàn)象。

3討論

因先天性畸形、外傷及頭、頸、四肢的腫瘤切除術(shù)等各種原因所引起的全身各部位的組織器官的缺損不僅造成了外形上的缺陷，而且會(huì)引起不同程度的功能障礙，給患者的心靈帶來(lái)了巨大的傷害。自體脂肪組織是修復(fù)各類(lèi)組織缺損的最佳填充物， 但如何保持移植脂肪組織生物活性一直是整形外科學(xué)界及所有修復(fù)外科面臨的重要難題之一。體內(nèi)脂肪組織一旦離開(kāi)活體常易出現(xiàn)變性、壞死，如整形外科最常見(jiàn)的小顆粒脂肪移植術(shù)，常因脂肪組織耐受組織缺氧能力差而出現(xiàn)壞死，究其原因是常規(guī)的整形技術(shù)是將供區(qū)數(shù)以萬(wàn)計(jì)或十萬(wàn)計(jì)脂肪細(xì)胞團(tuán)塊即時(shí)移植至受區(qū)，由于營(yíng)養(yǎng)障礙，大量移植脂肪細(xì)胞壞死，即使部分細(xì)胞成活，該成活脂肪細(xì)胞仍無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象，極易褪化，移植后數(shù)月逐漸喪失脂肪細(xì)胞特性，由成纖維細(xì)胞逐漸替代[1-2]。如何保持其旺盛擴(kuò)增狀態(tài)，維持其脂肪細(xì)胞特性，是脂肪組織移植成功的關(guān)鍵[3]。

組織工程學(xué)(tissue engineering)是近10多年提出的新概念，它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，研究開(kāi)發(fā)修復(fù)、改善損失組織結(jié)構(gòu)和功能的生物替代物的一門(mén)科學(xué)。其基本原理和方法是將體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體降解吸收的生物材料上形成復(fù)合物，將細(xì)胞生物材料復(fù)合物植入機(jī)體組織、器官的病損部分，細(xì)胞在生物材料逐漸被機(jī)體降解吸收的過(guò)程中形成新的形態(tài)和功能方面與相應(yīng)器官、組織相一致的組織，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。組織工程一經(jīng)提出，就受到各國(guó)學(xué)者的重視，組織工程發(fā)展至今已取得了豐碩的成果，目前已在軟骨、骨、皮膚、肝臟等領(lǐng)域取得可喜的進(jìn)展[4-5]，某些組織已進(jìn)入臨床應(yīng)用。生物可降解材料是組織工程研究中主要采用的材料 ，有聚乳酸 (polylatic acid，PLA)，聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)和它們的共聚物 (PLGA)，聚丁酸(polyhydroxybutyrate，PHB)等，這些可吸收的ECM（extral cell material）已獲得美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，可應(yīng)用于人體內(nèi)。組織工程化的脂肪組織構(gòu)建為解決上述問(wèn)題提出一條新的思路。

種子細(xì)胞為組織工程的主要基本要素，脂肪細(xì)胞系由起源于中胚層的多能干細(xì)胞逐步分化、發(fā)育而成，其過(guò)程大致為:多能干細(xì)胞→間充質(zhì)前體細(xì)胞→前脂肪細(xì)胞→成熟的脂肪細(xì)胞。前脂肪細(xì)胞(preadipocyte)是一類(lèi)能夠增殖并向脂肪細(xì)胞分化的特異化的前體細(xì)胞，由于前脂肪細(xì)胞不含脂滴 ，體積小，有促血管生成特性，在細(xì)胞的收集與移植過(guò)程中比成熟的脂肪細(xì)胞更能耐受缺血與創(chuàng)傷，尤其在脂肪移植后的缺血期，使單個(gè)細(xì)胞比塊狀脂肪更易通過(guò)細(xì)胞融合而成活，而且前脂肪細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下即可生長(zhǎng)(目前已可以常規(guī)培養(yǎng)人、鼠及豬的前脂肪細(xì)胞 ) [6]，使其有可能成為構(gòu)建組織工程脂肪組織的理想種子細(xì)胞。但由于前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的影響因素較多，且作為脂肪組織工程基本要素的種子細(xì)胞即前脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞極易老化，從而喪失增殖和分泌基質(zhì)的能力，如何防止細(xì)胞老化和獲得足量的細(xì)胞來(lái)源，是首先要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，而要解決這些問(wèn)題，將組織工程與基因工程有機(jī)地結(jié)合，無(wú)疑是最有效的途徑。

眾所周知，Bcl-2與Bax是 Bcl-2基因家族中功能相反的兩個(gè)重要成員，分別具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，Bcl-2與Bax的比值被認(rèn)為是決定細(xì)胞生死存亡的關(guān)鍵點(diǎn)之一。據(jù)報(bào)道，肥胖大鼠棕色脂肪細(xì)胞處于產(chǎn)能靜止?fàn)顟B(tài)，Bcl-2與Bax比值下降，細(xì)胞凋亡多，冷刺激或用腎上腺素處理后，該比值升高，細(xì)胞凋亡減少[7]。

RNAi是最近幾年發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來(lái)的新興的基因阻斷技術(shù).近年來(lái)的研究表明，一些小的雙鏈RNA可以高效、特異的阻斷體內(nèi)某些基因致使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，稱(chēng)為RNA干擾(RNA interfenence，RNAi)。由于RNAi具有高度的序列專(zhuān)一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，它可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具，將功能未知的基因的編碼區(qū)(外顯子)或啟動(dòng)子區(qū)以反向重復(fù)的方式由同一啟動(dòng)子控制表達(dá)，這樣在轉(zhuǎn)基因個(gè)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA可形成dsRNA，產(chǎn)生RNA干涉 ，使目的基因沉默。Lassus P等人[8]研究證明RNAi技術(shù)作為一種實(shí)用工具，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)沉默，使得許多以前我們無(wú)法運(yùn)用傳統(tǒng)的功能基因組學(xué)的技術(shù)方法研究的機(jī)制和模型成為可能，開(kāi)創(chuàng)了研究基因和蛋白質(zhì)功能的新天地。

本研究從人體脂肪組織中提取人前脂肪細(xì)胞作為種子細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，利用RNAi技術(shù)，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要的凋亡調(diào)控基因Bax基因表達(dá)沉默，以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的增殖和分化，抑制其凋亡。經(jīng)上述處理的前脂肪細(xì)胞進(jìn)再和可降解人工細(xì)胞外基質(zhì)（PLGA）混合培養(yǎng)，于裸鼠背部皮下體內(nèi)構(gòu)建組織工程化脂肪組織獲得初步成功，為以后探索治療軟組織缺損的新的途徑打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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[收稿日期]2008-07-11[修回日期]2008-09-27

編輯/張惠娟