Ｐ２７^ｋｉｐｌ和ｋｉ－６７蛋白在病理性瘢痕組織中的表達(dá)和意義

[摘要]目的：研究病理性瘢痕組織中P27kipl和ki-67蛋白的表達(dá)情況及其相互關(guān)系，探討他們在瘢痕形成中的作用及機(jī)制。方法：應(yīng)用免疫組化SP法檢測正常皮膚、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中P27kipl、ki-67蛋白的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：病理性瘢痕組織中P27kipl蛋白表達(dá)顯著低于正常皮膚、成熟瘢痕（P=0.036）; ki-67蛋白在病理性瘢痕組織中的表達(dá)顯著高于正常皮膚、成熟瘢痕（P＜0.000）；病理性瘢痕組織中P27kipl的表達(dá)與ki-67蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.000）。結(jié)論：P27kipl蛋白表達(dá)的下降及ki-67的表達(dá)升高可能與病理性瘢痕的形成有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]P27kipl蛋白；ki-67蛋白；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩

[中圖分類號(hào)]Q813 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2008）10-1477-03

Expression and significance of P27kipl and ki-67 protein in pathological scar

WU Wen-yi，ZHU Shi-ze，WU Rui-lan，ZOU Cheng-hao，WANG Zhao-yang，HUANG Zhong-xin

(Departent ofPlastic Surgery，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou362000，F(xiàn)ujian，China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression of P27kipl and ki-67 in the pathological scars and their reaction-ship and to investigate its role and its possible mechanism in the pathogenesis of abnormal scars.MethodsImmunohistochemiscal technique was performered to detect the expression and distribution of P27kipl and ki-67 protein in hypertrophic scar (42cases)， keloid (18cases)， normal scar (40 cases) and normal skin (50cases)，statistics was used to analyze the data.ResultsThe positive rate of P27kipl and ki-67 protein expression were remarkably significant in comparison between normal scar and abnormal scar(P<0.05). In pathological scar the protein of P27kipl and ki-67 showed a strong inverse correlation (P<0.000). ConclusionLow expression of P27kipl and high expression of ki-67 may play an important role in the proliferation of fibroblasts and in the pathogenesis of pathological scar.

Key words: P27kipl protein；ki-67 protein；hypertrophic scar；keloid

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是臨床上最常見的病理性瘢痕，其形成機(jī)制仍不十分清楚。近年來研究表明，病理性瘢痕的形成是以細(xì)胞的增生和凋亡失衡為基礎(chǔ)的[1-2]。深入研究細(xì)胞增殖和凋亡在病理性瘢痕形成中的作用，將有利于揭示其發(fā)病機(jī)制。P27kipl 是一種廣譜的周期蛋白依賴性激酶抑制劑，是G1/S期限制的重要調(diào)控分子。ki-67是被公認(rèn)的反映細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物。我們應(yīng)用免疫組化方法，檢測了增生性瘢痕、瘢痕疙瘩組織中P27kipl、 ki-67蛋白的表達(dá)情況，并與成熟瘢痕；正常皮膚作了比較，初步探討P27kipl、ki-67的表達(dá)與病理性瘢痕形成的關(guān)系，為瘢痕的防治提拱一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1 組織標(biāo)本：瘢痕疙瘩標(biāo)本18例，其中男性11例，女性7例，年齡4～37歲，平均21歲。部位：胸骨前10例，面頸肩部4例，耳垂部和臀部4例。術(shù)前均未做化療和放療，1年內(nèi)無局部注射、外用藥物，瘢痕局部無治療；增生性瘢痕42例，男26例，女16例，年齡3～47歲，所取部位與瘢痕疙瘩基本相近；同時(shí)于手術(shù)時(shí)取瘢痕周圍正常皮膚50例；另取成熟瘢痕組織40例，瘢痕病程均為6個(gè)月以上，最長123個(gè)月，平均16個(gè)月，均經(jīng)臨床和病理確診，無惡性變。標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，貼于涂有0.05%多聚賴氨酸的載玻片備用。

1.2 主要試劑：鼠抗人P27kipl 單克隆抗體（ZM-03040）、鼠抗人ki-67單克隆抗體（ZM-0165）、SP免疫組化超敏染色試劑盒和DAB顯色試劑盒（均購自福州邁新生物技術(shù)公司）。

1.3 方法：標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，作SP法免疫組化染色。用已知的上述抗體染色陽性的組織作陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。SP法參試劑盒的說明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定：①P27kipl 陽性細(xì)胞為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)都有著色，胞質(zhì)染色稍深，有時(shí)可見胞質(zhì)中成云團(tuán)狀的深染區(qū)。ki-67陽性細(xì)胞呈棕褐色定位于細(xì)胞核。每例隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高位視野（×400），確定每一個(gè)視野的陽性率（每個(gè)視野計(jì)數(shù)500個(gè)成纖維細(xì)胞或皮膚基底細(xì)胞，取平均數(shù)，即為陽性細(xì)胞數(shù)）；②P27kipl 染色判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[3]：陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，10%～30%為1分，30%～60%為2分，>60%為3分；陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度：基本不差色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分，兩者得分相乘，少于1分的病例判定為表達(dá)陰性，其余的病例判定為表達(dá)陽性。ki-67： 根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占百分率，得出標(biāo)記指數(shù)(labeling index，LI)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：P27kipl染色差異采用χ2 檢驗(yàn)， 不同組別ki-67及P27kipl與ki-67相互關(guān)系采用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPS11.5的軟件包對數(shù)握進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2結(jié)果

2.1 P27kipl、ki-67蛋白在瘢痕和正常皮膚組織中的表達(dá)情況：見表1、表2。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P27kipl蛋白在瘢痕組織、正常細(xì)胞細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)都有著色，胞質(zhì)染色稍深，有時(shí)可見胞質(zhì)中成云團(tuán)狀的深染區(qū)（如圖1、圖2），P27kipl蛋白在病理性瘢痕組織中表達(dá)與其在正常皮膚、成熟瘢痕中的表達(dá)有顯著性差異（P=0.036）。

2.3 ki-67陽性表達(dá)于細(xì)胞核，呈顆粒狀的棕黃色（如圖3、圖4），ki-67在成熟瘢痕、正常皮膚幾乎不表達(dá)，在病理性瘢痕組織中的表達(dá)與其在正常皮膚、成熟瘢痕中的表達(dá)有顯著性差異(P<0.000)，增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中P27kipl和ki-67蛋白表達(dá)有顯著性差異（P<0.000），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可推斷 P27kipl蛋白與ki-67蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

3討論

真核細(xì)胞周期的進(jìn)程由許多因子調(diào)控，其中最令人注目的是細(xì)胞周期蛋白（cyclins）、周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和CDKs抑制劑（CKIs）構(gòu)成的復(fù)雜的調(diào)控體系。CKIs根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為兩大家族：特異性地與CDK4和CDK6結(jié)合并發(fā)揮抑制作用的INK4（inhibitors of CDK4）家族和具有更加廣譜的抑制活性的CIP/KIP（cdk-interacting protein/kinase inhibitor protein）家族[4]。P27kipl 是CIP/KIP家族的重要成員，1994年由Polyak等[5]在轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和細(xì)胞接觸抑制導(dǎo)致的靜止細(xì)胞抽提物中發(fā)現(xiàn)。大量的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，P27kipl是一種廣譜的周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它能夠與多種Cyclin-CDKs復(fù)合物結(jié)合并抑制其活性，是細(xì)胞G1/S期限制點(diǎn)（restriction point）的重要效應(yīng)分子，對細(xì)胞周期具有負(fù)調(diào)控作用，P27kipl低表達(dá)必然導(dǎo)致對細(xì)胞周期進(jìn)展抑制不力[6]。ki-67是在細(xì)胞G1、S、G2、M期出現(xiàn)的核抗原，表達(dá)的高低直接反映了細(xì)胞增殖狀態(tài)[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P27kipl蛋白在病理性瘢痕組織中的表達(dá)降低，與其在正常皮膚、成熟瘢痕中的表達(dá)有顯著性差異；ki-67蛋白在病理性瘢痕組織中表達(dá)較高，與其在正常皮膚、成熟瘢痕中的表達(dá)有顯著性差異，在瘢痕組織中P27kipl 蛋白表達(dá)與ki-67蛋白呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，病理性瘢痕組織中P27kipl蛋白表達(dá)水平的下降或功能性失活可能導(dǎo)致了細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，Cyclin-CDKs等正性調(diào)控因子的作用不能被充分拮抗，細(xì)胞周期不斷循環(huán)，從而導(dǎo)致包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的組織修復(fù)細(xì)胞異常增殖分化，形成病理性瘢痕。

由于P27kipl很少發(fā)生基因突變，其mRNA的水平在整個(gè)細(xì)胞周期也基本恒定，導(dǎo)致P27kipl蛋白水平下降的原因主要是翻譯后機(jī)制：①P27kipl蛋白的降解增加。S期激酶相關(guān)蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，SKP2）依賴性的泛素-蛋白酶體途徑是P27kipl蛋白降解的主要途徑，這個(gè)途徑由cyclin E-cdk2對P27kipl適當(dāng)位點(diǎn)的磷酸化啟動(dòng)[8]。我們已實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SKP2在病理性瘢痕組織中表達(dá)升高，與P27kipl呈負(fù)相關(guān)，并發(fā)表于2005年第6期《中華整形外科雜志》；②P27kipl的亞細(xì)胞定位發(fā)生變化。P27kipl只有在細(xì)胞核中才能發(fā)揮其對CDK的抑制作用，參與P27kipl胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制至今尚未明確，有研究[9]提示Jabl、Ser10的磷酸化狀態(tài)以及D類周期蛋白的“扣留”作用都與此有關(guān)。以上機(jī)制均有待于進(jìn)一步深入探討。

病理性瘢痕的發(fā)生與腫瘤一樣是多步驟、多階段的演進(jìn)過程，本研究結(jié)果顯示P27kipl 蛋白在病理性瘢痕組織中表達(dá)水平較正常皮膚、成熟瘢痕組織高，與ki-67蛋白呈負(fù)相關(guān)，提示P27kipl可能參與了成纖維細(xì)胞的分化，增生或表型轉(zhuǎn)化，在瘢痕形成過程中起著重要作用。深入探討P27kipl蛋白表達(dá)水平下降的原因及其與其他癌基因和抑癌基因在瘢痕形成中的確切激活機(jī)制和相互作用，不僅有助于認(rèn)識(shí)其成因和發(fā)展規(guī)律，而且有可能為瘢痕治療提供一個(gè)新思路。

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[收稿日期]2006-12-12[修回日期]2008-09-25

編輯/張惠娟