一種脫細胞真皮基質(zhì)制備方法的研究

[摘要]目的：研究脫細胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）的一種新的制備方法。方法：取大鼠背部皮膚制成厚度0.8mm的脫毛皮片，置入1mol/L NaCl溶液中24h，揭去表皮層，再浸入0.5%Triton X-100溶液中室溫震蕩48h，得到ADM。取標本行組織學(xué)觀察，并行異體移植實驗。結(jié)果：NaCl-Triton法制作的ADM，細胞成分脫除徹底，膠原纖維排列規(guī)則，沒有明顯的免疫原性，生物相容性好。結(jié)論：采用NaCl-Triton法制備ADM，價廉而有效，利于推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]脫細胞真皮基質(zhì)，制備

[中圖分類號]Q813[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2008）08-1176-02

Research to a preparation method of acellular dermal matrix

MAO Yu-long1，LV Ji-zhong2，SONG Bing1

(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Binzhou Medical Collage Affiliated Hospital， Binzhou 256603， Shandong， China; 2.Department of Stomatology， Heze Medical Collage)

Abstract：ObjectiveTo research a new method of producing acellular dermal matrix (ADM). MethodsThe non-hair skin grafts with 0.8mm in thickness were acquired from the back of Wistar rats'. Then the grafts were treated with 1M NaCl 4℃ for about 24 hours to rip away the cuticular layers， and the remained dermis were immerged into 0.5%Triton X-100 shaking in normal temperature for about 48 hours to obtain ADM. Took samples of the ADM to do histology observation， and homoplastic tronsplantation.ResultsThere was no cell constituent remained in ADM produced by NaCl-Triton method， and the collagen fibers were in a regular arrangement. ADM had very low immunocompetence and good biocompatibility.ConclusionUsing NaCl-Triton method to produce ADM was low-cost and effective， so it was advantageous to populize application.

Key words：acellular dermal matrix; preparation

皮膚或粘膜缺損是口腔頜面外科常見病癥。自體移植是最佳方式，但常面臨皮源不足的制約，故研究真皮替代物具有重要意義。脫細胞真皮基質(zhì)（acellular dermal matrix，ADM）源于天然皮膚，動物實驗和初期臨床應(yīng)用已證明其為理想的真皮替代物[1-2]。ADM的制備方法不一，結(jié)合文獻[3-4]，我們探討了利用NaCl-Triton法制備ADM的可行性。

1材料和方法

1.1實驗動物：健康成年雌性Wistar大鼠46只（購于山東大學(xué)實驗動物中心，合格證號SCXR(魯)20030004），體重(250±25)g，隨機分為供皮組（10只）和異體埋植組（36只）。

1.2 試劑與儀器：TritonX-100（美國amresco公司產(chǎn)品）；SCW-CJ-1B(1BU)型超凈工作臺（蘇州宏瑞凈化科技有限公司）；SGQ-250A鼓式自鎖取皮機（上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠）；IMAGE-PROPLUS病理圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.3 實驗步驟

1.3.1取皮：大鼠脫臼處死，背部剪毛，脫毛膏脫毛。切取全厚皮片后用鼓式取皮機反取為厚0.8mm，大小2cm×2cm皮片，共40塊，浸入0.1%新潔爾滅溶液脫脂30min。

1.3.2制備ADM：所有皮片置入1 mol/L NaCl溶液，4℃處理24h，揭去表皮層。再置于0.5%TritonX-100溶液中，常溫震蕩48h，開始每3～4h換液一次，至處理液不再變?yōu)榛鞚幔臑槊?h換液一次，制得ADM。取出ADM，PBS沖洗10min×7次，再將ADM浸于青霉素溶液抗菌處理30min。取出ADM將其放入滅菌生理鹽水中，4℃冰箱儲存。脫毛皮制備僅采用脫毛膏脫毛，不進行脫表皮和脫細胞處理。

1.4觀測指標

1.4.1 物理性狀：觀察ADM的質(zhì)地、顏色、彈性和韌性等。

1.4.2 組織學(xué)觀察：標本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，分別進行HE染色和VG染色，光鏡下觀察。同時取正常大鼠背部皮膚標本，做組織學(xué)對比觀察。

1.4.3 抗原性和生物相容性檢測：大鼠36只，24只埋植ADM，12只埋植脫毛皮。3%水合氯醛1ml/100g作腹腔注射麻醉，麻醉生效后于大鼠硬腭部兩側(cè)做距上頜磨牙腭側(cè)齦緣約0.1cm縱行切口，前端止于第一磨牙近中水平，后端止于第三磨牙遠中水平，以骨膜剝離器將粘骨膜從骨面剝離，前后端均不斷蒂。將ADM由一側(cè)切口塞入粘骨膜下，使其基底膜面面向粘骨膜，平展于粘骨膜和骨面之間。同樣方法埋植脫毛皮。分別于埋植后7天，14天，28天處死動物，切取標本，4%多聚甲醛固定，行HE染色，光鏡下觀察。

2結(jié)果

2.1大體觀察：所得ADM質(zhì)地柔軟，在其表面可見較多毛囊開口，伸展性好，有較大的拉伸強度，彈性較差。

2.2組織學(xué)觀察：真皮內(nèi)各種細胞成分均已被脫除，血管及毛囊部位余留空隙，膠原纖維纖細，排列尚整齊，基底膜結(jié)構(gòu)完好（見圖1）。

2.3抗原性和生物相容性：移植后7天，局部有少量炎性細胞浸潤，并有成纖維細胞移入ADM；14天，成纖維細胞數(shù)量較多，大量新生毛細血管長入，細胞無壞死及異型性變，纖維無水腫及壞死，未見明顯炎癥細胞；28天，ADM與粘骨膜貼合緊密，細胞數(shù)目變少，未見膠原纖維異常。脫毛皮在7天有大量炎細胞浸潤（中性粒細胞），組織水腫明顯，周邊有積液；14天，脫毛皮內(nèi)仍有較多炎細胞，出現(xiàn)少量成纖維細胞，膠原支架疏松；28天，脫毛皮膠原纖維更加疏松，仍見到較多量的淋巴細胞，成纖維細胞分布范圍增加。

3討論

ADM的制備要點在于盡可能地去除細胞成分，同時盡量完整保留其內(nèi)的基質(zhì)支架。目前常采用的制備主要有DispaseⅡ-Triton法、高滲鹽-SDS法、高滲鹽-酶消化法和NaOH銷蝕法等。上述方法都有一定的劣勢：NaOH銷蝕法膠原破壞較重；高滲鹽-SDS法和高滲鹽-酶消化法等雖基底膜保存較好，但Ⅳ型膠原纖維，纖維連接素含量較多，而且殘留微弱的HLA-DR活性，因而有相對高的抗原性；DispaseⅡ、胰蛋白酶等價格相對較高，操作過程復(fù)雜，其制作的ADM成本過高，不適于批量生產(chǎn)[5]。

分析文獻報道，我們首次聯(lián)合使用高滲鹽（NaCl）和 Triton制備ADM。高滲鹽可作用于基底膜復(fù)合物，使錨著細絲與表皮基底細胞半橋粒離斷，分開表皮層與真皮層，與DispaseⅡ相比能保留更完整的基底膜[3]。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑，能與生物膜中的磷脂等脂質(zhì)結(jié)合形成可溶性的復(fù)合物，溶解于溶液，進而使真皮細胞及其細胞器溶解，使細胞成分自纖維支架上脫除[6]，其脫細胞能力要強于SDS。二者聯(lián)用可取得理想效果。我們實驗觀察到：使用高滲鹽作用24h，可以完整揭除表皮層；再應(yīng)用Triton常溫振蕩48h，經(jīng)組織學(xué)檢驗可完成去除真皮中的細胞成分，保留較完整的纖維支架，得到ADM。硬腭粘膜下異體移植后觀察發(fā)現(xiàn)：與脫毛皮引發(fā)明顯的炎癥反應(yīng)相比，ADM不被機體排斥，并和周圍腭部組織融合，這提示此法制得的ADM無明顯免疫原性，生物相容性好。同時制備的試劑采用NaCl和Triton X-100組合。NaCl價格低廉，來源廣泛，Triton X-100溶液僅使用極低濃度，這樣極大地降低了制備成本，利于推廣應(yīng)用。

ADM作為一種新興真皮替代物，因為其低抗原性、快速血管化和一定的穩(wěn)定性，應(yīng)用于臨床修復(fù)口腔頜面皮膚和粘膜缺損取得可觀的效果。我們采用NaCl-Triton法制備出合格的ADM，證明此法低廉而有效，適合批量生產(chǎn)。

[參考文獻]

[1]Tung CS， Zighelboim I， Scott B， et al. Human acellular dermal matrix for closure of a contaminated gynecologic wound[J]. Gynecol Oncol， 2006， 103(1):354-356.

[2]Adams JE， Steinmann SP.Interposition arthroplasty using an acellular dermal matrix scaffold[J]. Acta Orthop Belg， 2007， 73(3):319-326.

[3]Walter RJ， Matsuda T， Reyse HM， et a1.Characterization of acellular dermal matrices(ADMS) prepared by two different methods[J].Burns，1998，24(2):104-113.

[4]左金華，李金榮，李武修.一種脫細胞真皮基質(zhì)制備方法的初探[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2003，19(4):258-260.

[5]Mizuno H，Takeda A，Uchinuma E.Creation of an acellular dermal matrix from frozen skin[J]. Aesthetic Plast Surg， 1999， 23(5):316-322.

[6]宋金丹.醫(yī)學(xué)細胞生物學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1995:62-63.

[收稿日期]2008-05-14[修回日期]2008-08-13

編輯/張惠娟