皮瓣缺血再灌注損傷與細胞凋亡的研究進展

皮瓣移植是整形外科常用的修復(fù)組織缺損和器官再造的重要手段。應(yīng)用游離皮瓣或軸形皮瓣進行組織移植和器官再造時，最常遇見的問題是皮瓣缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion，IR)導(dǎo)致的皮瓣部分或全部壞死。缺血再灌注損傷的確切發(fā)生機制目前尚不完全清楚，多認為是多細胞參與、多種介質(zhì)共同發(fā)揮作用的復(fù)雜病理生理過程，其中細胞凋亡是造成皮瓣壞死的重要原因。近年來有關(guān)各種組織細胞缺血再灌注損傷與細胞凋亡(apoptosis)的關(guān)系已經(jīng)取得了一定進展。本文對細胞凋亡、器官和組織缺血再灌注損傷中細胞損傷的發(fā)病機制及其與細胞凋亡的關(guān)系、凋亡相關(guān)基因的研究進展綜述如下。

1細胞凋亡

細胞凋亡是細胞在生理和病理情況下的一種死亡模式。此概念由美國病理學(xué)家Kerr 等[1] 在1972 年首先提出，是指細胞受到一些特殊信號刺激后，按照內(nèi)在程序，即細胞預(yù)存的死亡程序，由其自身內(nèi)部機制調(diào)控的主動細胞死亡，屬于機體自身的生理活動， 又稱為程序性細胞死亡(programmed cell death ，PCD) 。細胞凋亡過程受基因嚴格調(diào)控，與細胞壞死有顯著的差別。

1.1細胞凋亡的機制：細胞凋亡是細胞在其生長、發(fā)育過程中具有十分重要作用的生理現(xiàn)象。其生物學(xué)意義是在發(fā)育過程中清除多余的細胞、發(fā)育不正常的細胞、已完成任務(wù)的細胞以及有害的細胞，參與免疫系統(tǒng)細胞的發(fā)育和克隆選擇等，是確保機體正常生理過程所必須的。隨著研究的深入，人們認識到細胞凋亡和細胞的生長、分化、消亡以及機體的許多生理和病理過程密切相關(guān)。

1.2細胞凋亡的過程：可分為三期：①誘導(dǎo)期：凋亡誘導(dǎo)因素作用于細胞，導(dǎo)入死亡信號； ②執(zhí)行期：凋亡相關(guān)基因激活，決定死亡的細胞按預(yù)定程序啟動凋亡，激活凋亡所需的核酸內(nèi)切酶、凋亡蛋白酶等及降解相關(guān)物質(zhì)，形成凋亡小體；③消亡期：凋亡細胞被鄰近的細胞所吞噬并在吞噬細胞內(nèi)降解。

1.3細胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變:微絨毛、細胞突起和細胞表面皺褶消失，胞膜迅速空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴張并與胞膜融合，形成膜表面的芽狀突起，即出芽；胞質(zhì)脫水而導(dǎo)致細胞皺縮、致密及固縮，線粒體變大，嵴增多，空泡化；核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，形成染色質(zhì)塊，邊聚或中聚；胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)，形成泡狀小體即凋亡小體，這是凋亡細胞特征性的形態(tài)學(xué)改變。凋亡小體迅即被鄰近的細胞吞噬和消化。整個凋亡過程沒有細胞內(nèi)涵物的外溢，故不引起炎性反應(yīng)與周圍組織損傷。

1.4 細胞凋亡的生化改變:細胞染色質(zhì)DNA 的降解是細胞凋亡的一個顯著特征。細胞凋亡發(fā)生時，Ca²⁺/Mg²⁺ 依賴性核酸內(nèi)切酶激活，切割核小體間的DNA，最后形成長度為180～200堿基對(bp)或其整倍數(shù)的片段，在瓊脂糖凝膠電泳中呈“梯”狀(ladder pattern) 條帶，是判斷凋亡發(fā)生的客觀指標。

2缺血再灌注損傷

缺血的組織、器官經(jīng)恢復(fù)血流灌注后不但不能使其功能和結(jié)構(gòu)恢復(fù)，反而加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷（IR）。這是一種常見的病理生理過程，可發(fā)生在腦梗死、心肌梗死、休克、手術(shù)創(chuàng)傷、肝門阻斷術(shù)及皮瓣移植和器官再造過程中。關(guān)于缺血再灌注損傷的發(fā)病機制與下列因素密切相關(guān)。

2.1 自由基生成增多

2.1.1黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤生成增多:組織缺血時，一方面由于ATP生成減少，膜泵功能障礙，Ca進入細胞，激活Ca依賴性蛋白水解酶，使細胞內(nèi)大量黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，另一方面，ATP被降解為ADP、AMP和次黃嘌呤，故在缺血時組織內(nèi)次黃嘌呤大量堆積。再灌注時，大量分子氧隨血液進入缺血組織，在黃嘌呤氧化酶將次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤并進而催化黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的兩步反應(yīng)中，都以分子氧為電子接受體產(chǎn)生大量氧和過氧化氫，后者在金屬離子參與下形成OH，因此再灌注時組織內(nèi)氧、OH等氧自由基大量產(chǎn)生。

2.1.2 中性粒細胞的大量積聚和激活[2-3]：中性粒細胞在吞噬活動加強時耗氧量顯著增多，所攝取的氧絕大部分經(jīng)白細胞內(nèi)的NADPH氧化酶和NADH氧化酶的作用形成超氧陰離子，如果形成的自由基過多或機體清除自由基的酶系統(tǒng)活性不足，則導(dǎo)致氧自由基增多。

2.1.3 線粒體功能受損：缺血再灌注時，Ca進入線粒體增多，使其功能受損，細胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)，進入細胞的氧經(jīng)單電子還原而形成氧自由基。

2.1.4 酚胺的增多和氧化：在各種應(yīng)激包括缺氧條件下，交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)可分泌大量兒茶酚胺，一方面它具有重要的代償作用，另一方面兒茶酚胺氧化時能產(chǎn)生具有細胞毒性的自由基。

2.1.5 四烯酸代謝過程增強：缺血再灌注時，由于細胞內(nèi)鈣超載激活了Ca依賴性磷脂酶，引起花生四烯酸代謝產(chǎn)生大量氧自由基。

2.2 鈣超載的機制

2.2.1 近年來大量研究表明Na⁺/Ca²⁺交換是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子平衡的主要途徑[4-6]。IR時組織內(nèi)ATP生成減少，細胞內(nèi)酸中毒，Na⁺在細胞內(nèi)積聚，激活了Na⁺/Ca²⁺交換系統(tǒng)，使大量Ca進入細胞內(nèi)形成鈣超載。

2.2.2 IR時大量自由基產(chǎn)生，作用于鈣通道，增加Ca²⁺通透性，而且由于ATP生成減少，鈣泵排Ca²⁺的能力下降，導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca增多。

2.3能量代謝障礙：實驗證明，在缺血再灌注時，由于缺氧和血流量不足，組織缺血，可導(dǎo)致能量代謝障礙，ATP明顯下降。可進一步引起一系列代謝異常和紊亂：①組織缺血時，組織內(nèi)ATP生成減少，細胞內(nèi)酸中毒，導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生增加。此外酸中毒又可直接損害細胞的超微結(jié)構(gòu)，使Ca²⁺通道通透性增加，致使Ca²⁺內(nèi)流增加。同時Na⁺在細胞內(nèi)積聚，激活了Na⁺/Ca²⁺交換系統(tǒng)，使Ca²⁺進入細胞內(nèi)形成鈣超載；②隨ATP含量的下降，細胞膜、肌漿網(wǎng)Ca²⁺-ATP酶活力及肌漿網(wǎng)鈣攝取能力下降，使細胞內(nèi)Ca²⁺增加；③依賴ATP的細胞膜泵活性降低，肌鈣蛋白C親和力下降，使Ca²⁺增加。

2.4 血管內(nèi)皮細胞功能障礙

2.4.1 內(nèi)皮細胞抗氧化系統(tǒng)損傷：研究證明[7]內(nèi)皮細胞的抗氧化活性與其對氧化活性的敏感性之間有一定關(guān)系。組織缺血再灌注時，內(nèi)皮細胞不僅產(chǎn)生大量的活性氧，而且其抗氧化活性大大降低，并對外源性的活性氧產(chǎn)生系統(tǒng)有較高的敏感性，從而引起大量活性氧的產(chǎn)生，遠遠超過了內(nèi)皮細胞的防御能力，最終引起組織的損傷。

2.4.2 內(nèi)皮細胞合成與釋放血管活性物質(zhì)的功能障礙：①內(nèi)皮源性血管舒張因子NO是內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的強大舒血管物質(zhì)，可通過彌散或載體轉(zhuǎn)運至血管平滑肌，活化細胞內(nèi)鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷鳥苷(cGMP)升高而擴張血管;同時還具有抑制血小板和白細胞粘附、抑制平滑肌細胞增殖作用，在缺血再灌注中對組織具有保護作用；②內(nèi)皮素( ET)在組織缺血時釋放增加，再灌注時ET釋放進一步增加，引起強烈的血管收縮，可直接引起組織缺血，加重血管功能障礙，使細胞發(fā)生不可逆性損傷；③缺血再灌注損傷引起中性粒細胞與內(nèi)皮細胞的粘附增加，中性粒細胞與血管內(nèi)皮接觸時即被激活，釋放OFR等毒性產(chǎn)物及破壞性蛋白酶，改變血管的通透性。同時活性氧產(chǎn)生的增加，損傷了內(nèi)皮細胞和其他細胞，其作用于內(nèi)皮細胞或粒細胞表面的粘附分子，促進內(nèi)皮細胞的粘附，而缺氧本身也損傷內(nèi)皮功能，改變其粘附性，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞破損、水腫和功能障礙，毛細血管腔被阻塞，導(dǎo)致雖有大血管的再灌注但局部缺血區(qū)仍無復(fù)流的現(xiàn)象[8]。

2.5 缺血再灌注時，組織細胞產(chǎn)生大量細胞因子和生長因子致組織損傷：組織發(fā)生缺血再灌注損傷后，由于氧自由基、髓過氧化物酶及彈性蛋白酶的大量產(chǎn)生，血小板活化因子及許多炎癥介質(zhì)如激活的補體、白介素（IL-1、IL-6、IL-8、TGF）、TNF等大量釋放，以及細胞周圍環(huán)境中的生長因子（血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、巨噬細胞集落刺激因子）等，引起內(nèi)皮細胞或白細胞表面特殊粘附分子的表達，從而使細胞粘附蛋白介導(dǎo)的中性粒細胞與內(nèi)皮細胞發(fā)生粘附，誘導(dǎo)中性粒細胞穿內(nèi)皮遷移以及對缺血組織的浸潤和損傷。并通過誘導(dǎo)細胞凋亡因子的產(chǎn)生，進一步對組織細胞造成損害。

2．6 缺血再灌注損傷時細胞凋亡的相關(guān)凋亡基因:研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注的發(fā)生發(fā)展過程中，Bcl-2基因家族、Fas基因、P53、caspase、即早基因等多種凋亡基因均參與了凋亡的發(fā)生。這些調(diào)控基因相互調(diào)節(jié)和制約，構(gòu)成了一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，共同調(diào)控著缺血再灌注后細胞凋亡的發(fā)生。

目前多數(shù)學(xué)者認為，IR是各種因素相互作用、相互促進共同作用的結(jié)果。IR時生成的自由基可促進鈣超載，胞漿內(nèi)游離鈣增加又加速自由基產(chǎn)生，共同導(dǎo)致IR損傷。血管內(nèi)皮細胞和中性粒細胞作為IR中自由基、細胞粘附分子及其他生物活性物質(zhì)的重要來源，在IR損傷的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，此外細胞代謝紊亂及其產(chǎn)生的細胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細胞凋亡因子也參與了IR損傷過程。

3皮瓣缺血再灌注損傷與細胞凋亡

近年來大量的研究表明，缺血再灌注損傷的發(fā)生不僅來自缺血再灌注的直接作用，同時凋亡機制的啟動與放大后造成的組織壞死同樣也參與了上述組織的損傷過程。Schumer等 ［9］在缺血再灌注的大鼠腎臟組織觀察到細胞凋亡現(xiàn)象與缺血再灌注的關(guān)系。Gottlieb [10]于1994年首次在兔心臟上驗證了再灌注損傷所導(dǎo)致的心肌細胞凋亡 。有研究進一步表明，細胞凋亡是組織缺血再灌注損傷后細胞死亡的重要方式，并且組織缺血再灌注后細胞凋亡的發(fā)生與缺血的嚴重程度、再灌注時間的長短有關(guān)。其中Kuo等[11-14]進行實驗證實，凋亡細胞量的增加和再灌注損傷的程度相關(guān)，而且凋亡的程度與缺血再灌注損傷的生化和病理學(xué)參數(shù)成正相關(guān)。同時還在觀察中發(fā)現(xiàn)，當組織細胞發(fā)生缺血再灌注損傷時，未發(fā)生缺血的組織細胞在灌注后也發(fā)生細胞凋亡現(xiàn)象。從而推斷組織細胞發(fā)生凋亡后，可誘導(dǎo)相應(yīng)的凋亡分子和凋亡誘導(dǎo)分子釋放，導(dǎo)致正常的組織細胞發(fā)生死亡。概括起來缺血再灌注損傷與細胞凋亡存在如下關(guān)系：

3.1缺血再灌注損傷時氧自由基增多與細胞凋亡的關(guān)系：許多研究表明，氧自由基與細胞凋亡密切相關(guān)，可啟動細胞凋亡。其機制為[15]：①直接損傷DNA ，誘導(dǎo)細胞凋亡； ②誘發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化，從而影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激活相關(guān)促凋亡基因，導(dǎo)致細胞死亡； ③導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)，使具有酶活性的蛋白質(zhì)功能喪失；④影響核基因的轉(zhuǎn)錄，改變細胞的表型特征，誘導(dǎo)細胞凋亡。

3.2缺血再灌注損傷所致鈣超載與細胞凋亡的關(guān)系：鈣超載是組織缺血再灌注損傷的重要機制，也參與細胞凋亡過程，但其具體機制尚不清楚。可能與以下因素有關(guān)：①激活Ca²⁺ 依賴性磷酸酶，破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，ATP 生成減少，同時引起B(yǎng)cl-2 蛋白失活；②促進氧自由基的生成，進而促進細胞凋亡的產(chǎn)生；③激活Ca²⁺ 依賴性的核酸內(nèi)切酶，降解DNA；④激活Ca²⁺ 依賴性中性蛋白酶(caplain)，介導(dǎo)TNF 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和調(diào)控p53，從而誘發(fā)細胞凋亡。

3.3缺血再灌注損傷時線粒體通透性改變和能量代謝障礙與細胞凋亡的關(guān)系：細胞凋亡有兩條分子信號通路，其一為受體介導(dǎo)的死亡信號通路，主要由外源性信號引起。另一凋亡通路由線粒體介導(dǎo)，主要由內(nèi)源性信號所引起。通過細胞色素C的釋放，激活caspase 9 ，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)。另外線粒體膜腔內(nèi)還釋放許許多多肽，對凋亡起重要的調(diào)控作用。線粒體通透性改變可以作為死亡的閘門[16]，不但決定細胞的死亡或者生存，而且決定細胞的死亡機制，即凋亡或壞死。至于細胞走向凋亡還是壞死則取決于線粒體內(nèi)ATP水平[17]。在組織缺血情況下，細胞若仍能以糖酵解的方式提供ATP，則細胞走向凋亡。如ATP 已耗竭，則細胞走向死亡。

3.4缺血再灌注損傷時所釋放細胞因子與細胞凋亡關(guān)系：組織缺血再灌注損傷時，應(yīng)激產(chǎn)生大量的細胞因子，如TNF、IL-6、IL-8、TGF 等，以及細胞周圍環(huán)境中產(chǎn)生大量的生長因子（如：血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、巨噬細胞集落刺激因子等），通過細胞內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶介導(dǎo)，引起組織細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)直接注射TNF-α到活體組織內(nèi)，有凋亡典型的DNA 梯帶出現(xiàn)[18]，同時TNF-α還可致組織內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡[19]。TGF-β為多種上皮組織增殖抑制因子，體內(nèi)外實驗證實TGF-β可誘導(dǎo)組織細胞凋亡。經(jīng)過有絲分裂原誘導(dǎo)組織細胞凋亡的組織中，TGF-βmRNA 表達水平增高，說明TGF-β有致細胞凋亡的作用[20] 。

3.5缺血再灌注損傷時凋亡相關(guān)基因產(chǎn)生與細胞凋亡的關(guān)系：有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注中，有多種凋亡相關(guān)基因參與細胞凋亡的發(fā)生。凋亡相關(guān)基因多達數(shù)十種，根據(jù)功能不同可分為：①抑制凋亡基因：如Bcl-2； ②促進凋亡基因:Bcl-2 家族中的bax、Hrk、野生型p53；③雙向調(diào)控基因即早基因(IEGs)等，其中對Bcl-2 在缺血再灌注損傷中表達的研究較為深入。

3.5.1 Bcl-2 基因：Bcl-2 是缺血再灌注損傷中最重要的抗細胞凋亡基因，主要分布在線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等處。Bcl-2抗凋亡的機制為：①直接的抗氧化； ②調(diào)節(jié)線粒體功能:Bcl-2可抑制MTP 的功能，減少細胞色素C 的釋放，阻止凋亡蛋白酶的激活；③維持細胞Ca²⁺ 穩(wěn)態(tài)，細胞內(nèi)Ca²⁺ 濃度的升高是細胞凋亡的始動因素，Bcl-2 高表達可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca²⁺ ；④Bcl-2 與同族基因的bax 形成二聚體，Bcl-2 能抑制bax 誘導(dǎo)的細胞色素C釋放，阻止細胞凋亡。Bcl-2/Bax表達后的比例是決定細胞凋亡敏感性的變阻器[21]。

3.5.2 Fas：Fas是一種細胞表面受體，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR) 家族，F(xiàn)as配體(FasL)屬于TNF家族成員。Fas受體配體系統(tǒng)是激活細胞凋亡的最主要的受體介導(dǎo)途徑。Fas受體與FasL結(jié)合激活后，啟動凋亡信號的跨膜傳遞，F(xiàn)as的“死亡區(qū)段”(death doman，DD)與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白（FADDPMORT1）結(jié)合，并激活天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)8，進而導(dǎo)致caspase3的激活和一系列的級聯(lián)反應(yīng)，以Ca²⁺非依賴的形式誘發(fā)凋亡[22]。

3.5.3 p53基因：p53是與細胞DNA修復(fù)有關(guān)的重要細胞周期調(diào)控基因。野生型p53誘導(dǎo)細胞凋亡，突變型p53則抑制細胞凋亡。損傷后細胞核中野生型p53很快聚集，使細胞停止于G1PS 期，這使細胞難以恢復(fù)重新進入細胞周期。如DNA損傷過于嚴重，DNA 無法恢復(fù)，則產(chǎn)生細胞凋亡。同時研究還發(fā)現(xiàn)，野生型p53 能下調(diào)Bcl-2的表達[23]。p53 在不同細胞中誘導(dǎo)凋亡的機制不同，但最終都是通過細胞色素C釋放和caspase的激活而完成細胞凋亡。

3.5.4 caspase 基因家族：caspase 基因家族為半胱天冬氨酸蛋白酶家族，在細胞內(nèi)以非活性的酶原形式存在，激活后通過caspase 級聯(lián)反應(yīng)，引起蛋白分解，驅(qū)動細胞凋亡的發(fā)生。Cursio[24]的研究表明在肝缺血再灌注損傷（HIRI）后caspases 活性增加，提示caspases 的活性與HIRI 后細胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)。

3.5.5 即早基因(IEGS)：IEGS 是一組快速表達并參與細胞信息傳遞、生長、分化和損傷修復(fù)的原癌基因，包括c2fos、c2jun、c2myc等。IEGS編碼的蛋白在核內(nèi)起著轉(zhuǎn)錄因子的作用。IEGS在細胞凋亡過程中被激活，不僅可調(diào)節(jié)細胞凋亡程度，而且可促進細胞增殖。

4小結(jié)

皮瓣缺血再灌注損傷是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多途徑參與的復(fù)雜的病理過程，細胞凋亡是其損傷的一個重要特征。隨著對細胞凋亡研究的進一步深入，皮瓣缺血再灌注損傷的病理生理過程將會進一步得到揭示，從而為在分子和基因水平防治皮瓣缺血再灌注引起的細胞損傷提供理論依據(jù)，為進一步完善臨床治療提供新的有效途徑。這主要體現(xiàn)在以下兩個方面：①針對凋亡發(fā)生的不同環(huán)節(jié)，如消除或阻抑刺激因子，阻斷凋亡的信息傳導(dǎo)通路，如基因治療；②開發(fā)調(diào)節(jié)細胞凋亡的新藥物。

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[收稿日期]2008-06-03[修回日期]2008-08-06

編輯/李陽利