毛囊干細(xì)胞及其分離與識別方法的研究進(jìn)展

干細(xì)胞是指未成熟細(xì)胞，具有自我更新和分化能力，可分化為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞、其他細(xì)胞、組織及器官[1] ，胚胎干細(xì)胞是最有應(yīng)用價值的干細(xì)胞，但由于來源于胚胎，進(jìn)行相關(guān)研究和治療必然涉及倫理和道德問題，所以胚胎干細(xì)胞的研究受到限制，而來源于同體的成體干細(xì)胞就不存在這種限制。皮膚組織更新速度快、再生能力強(qiáng)，因此，來自皮膚局部的干細(xì)胞受到了重視。研究表明，毛囊干細(xì)胞( hair follicle stem cells ，F(xiàn)SC)能分化成毛囊、皮脂腺、表皮，是皮膚組織工程理想的種子細(xì)胞，已成為目前的研究熱點?，F(xiàn)就毛囊干細(xì)胞及其分離與識別方法的研究進(jìn)展綜述如下。

1毛囊的解剖特點

毛囊是表皮向真皮中凹陷后形成的特殊結(jié)構(gòu)，位于毛發(fā)下段。毛囊內(nèi)外由上皮性毛根鞘和毛囊周圍鞘兩部分組成， 兩者之間有玻璃膜。它包圍著毛根，上面附有立毛肌，亦與皮脂腺相連，其最外層被毛囊周圍鞘圍繞。上皮性毛根鞘起源于表皮， 又分內(nèi)根鞘和外根鞘。外根鞘相當(dāng)于表皮的基底層和棘細(xì)胞層。毛囊可分為上下兩部， 上部也稱為恒定部即毛囊的上段，可再分為漏斗部和峽部，在峽部末端外毛根鞘細(xì)胞增殖，并且形成隆突區(qū)(bulge)， 成為毛發(fā)上段的標(biāo)記。該隆突部位可環(huán)繞整個峽部末端或僅限于單側(cè)即立毛肌附著處， 目前被認(rèn)為是毛囊干細(xì)胞存在的主要部位。在毛囊的周期性生長過程中，這部分保持穩(wěn)定，不發(fā)生凋亡和再生。下部也稱為循環(huán)部，可再分為球部和莖部，包括隆突部以下的毛囊和毛球。在毛囊的周期性生長過程中，這部分呈現(xiàn)出生長、衰退、靜息和脫落的形態(tài)變化。根據(jù)循環(huán)部的變化，毛發(fā)再生過程中[2]，毛囊依次經(jīng)歷生長期、退化期、靜止期及脫落期，完成一個生長周期，毛囊周期生長是由毛囊干細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的共同作用完成的。

2毛囊干細(xì)胞的定位

目前普遍認(rèn)為毛囊干細(xì)胞定位于毛囊上段的隆突區(qū)。1990 年，Cotsarelis 等[3]采用連續(xù)[3H]-T 標(biāo)記發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚、睫毛、觸須的毛囊球部并未見標(biāo)記細(xì)胞及干細(xì)胞指征，但在隆突區(qū)可見，相反應(yīng)用脈沖[3H]-T標(biāo)記則發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物布滿毛母質(zhì)，而隆突區(qū)未見，于是提出“隆突激活假說”(bulge activation hypothesis) 。此后，Taylor 等[4]采用BrdU 和[3H]-T 雙標(biāo)記方法亦證實毛囊干細(xì)胞定位于上段的隆突區(qū)。在體外培養(yǎng)實驗中，將生長期小鼠毛囊橫切成四部分進(jìn)行分段培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)95%的克隆形成細(xì)胞來自于含有隆突區(qū)的片段，其余少數(shù)克隆來自于毛球部[5]；培養(yǎng)人毛囊細(xì)胞，亦發(fā)現(xiàn)克隆形成細(xì)胞主要出現(xiàn)在外根鞘中段，近似于立毛肌附著點[6]。盡管越來越多的人贊同決定毛囊下段周期性生長的干細(xì)胞定位于隆突區(qū)，然而利用干細(xì)胞慢周期特性和毛囊生長周期特點對人毛囊進(jìn)行體外分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人毛囊干細(xì)胞在胚胎期定位于隆突區(qū)，而在成人則定位于毛囊下段-隆突區(qū)以下的外根鞘中[7]。應(yīng)用毛囊干細(xì)胞特征標(biāo)記物角蛋白19(keratin 19，K19) 進(jìn)行檢測亦可見陽性細(xì)胞出現(xiàn)在隆突區(qū)和毛囊下段兩個區(qū)域[8]，這意味著毛囊中可能有兩個干細(xì)胞儲存庫，或者是在個體發(fā)育過程中早期細(xì)胞發(fā)生了下移的結(jié)果。此外，不同物種或同一物種的不同部位毛囊干細(xì)胞的定位都有所不同，如在手足部位，這些干細(xì)胞存在于表皮網(wǎng)狀嵴的深層，而在頭皮部位則定位淺表或位于表皮嵴的頂部及立毛肌附著的毛囊隆突區(qū)[9]。因此人類毛囊干細(xì)胞的確切定位尚有爭論，這妨礙了人們理解毛囊干細(xì)胞在上皮生物學(xué)、創(chuàng)傷愈合以及腫瘤發(fā)生中的作用。

3毛囊干細(xì)胞的分離及純化

許多研究者采用不同的方法試圖將毛囊干細(xì)胞分離出來，以進(jìn)行更深入的研究，目前對毛囊干細(xì)胞分離及純化有以下幾種方法：

3.1熒光標(biāo)記細(xì)胞激活技術(shù)也稱為流式細(xì)胞儀分選：這種方法可將帶有一種或幾種熒光標(biāo)記的細(xì)胞分選出來，原理科學(xué)，操作方便，被眾多研究者采用。2004年，F(xiàn)uchs等[10]利用該技術(shù)從毛囊隆突部純化出了毛囊干細(xì)胞，這種方法的優(yōu)點是準(zhǔn)確，但標(biāo)記細(xì)胞體外培養(yǎng)活力不好，不容易傳代培養(yǎng)。

3.2應(yīng)用酶消化法[11]：將皮膚樣本剪成小條，分離酶（dispase）低溫消化后鏡下切取毛囊隆突部，置于胰酶中37℃消化后1000r/min離心收集細(xì)胞加無血清的DMEM條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天換液。消化法分離的毛囊干細(xì)胞純度較高，細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞克隆形成能力強(qiáng)，增殖迅速被普遍應(yīng)用于毛囊干細(xì)胞的初步分離，但獲得的干細(xì)胞經(jīng)歷倍增期后，生長速度減慢，進(jìn)入平臺期，其原因可能是酶消化破壞了干細(xì)胞與微環(huán)境的聯(lián)系；有研究表明[12]，在應(yīng)用分離酶消化的過程中37℃消化2h，較以往4℃消化12h縮短了消化時間，能避免干細(xì)胞損傷。

3.3組織塊法分離毛囊隆突部干細(xì)胞[13-14]：將皮膚切成0.2cm×0.2cm大小的小塊，按表皮面朝上貼于玻璃平皿中，每皿3～4 塊，加適量培養(yǎng)液，氫化可的松+青鏈霉素100U/ mL，置于CO₂培養(yǎng)箱(5%CO₂，飽和濕度，37℃)中培養(yǎng)，每兩天換液一次。組織塊法分離得到的毛囊干細(xì)胞純度低于消化法，細(xì)胞生長比率低，細(xì)胞不易融合。但獲得的干細(xì)胞歷代倍增后仍處于增殖態(tài)勢，其原因可能是從組織塊中遷移出來其他種類的細(xì)胞可為干細(xì)胞營造一個類似于體內(nèi)的微環(huán)境，使干細(xì)胞受到的損害小。

3.4差速貼壁法純化毛囊干細(xì)胞[15-16]：應(yīng)用酶消化法分離得到細(xì)胞后離心收集細(xì)胞接種于IV 型膠原包被的培養(yǎng)皿中。收集上層未貼附角質(zhì)形成細(xì)胞和毛囊真皮成纖維細(xì)胞于另一皿中培養(yǎng)， 培養(yǎng)液為20%血清的DMEM ，每2天換液，收集條件培養(yǎng)基。貼附皿底的毛囊干細(xì)胞加無血清的DMEM條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，每3天換液?？寺⌒纬稍囼炞C實分離出來的干細(xì)胞純度大于90% ，克隆形成能力最強(qiáng)的細(xì)胞粘附到Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的速度最快[17]。此法將酶消化法得到的細(xì)胞進(jìn)一步純化，得到純度高的毛囊干細(xì)胞，目前被普遍應(yīng)用。

3.5顯微分離技術(shù)分離純化毛囊干細(xì)胞[18]:將皮膚樣品置入分離酶中4℃消化。從脂肪端拉出毛囊，收集形態(tài)完好且處于生長期的毛囊，體視顯微鏡下切取毛囊隆突部，含雙抗磷酸鹽緩沖液漂洗3次，加入DMEM/F12補(bǔ)充培養(yǎng)基于37℃、5%CO₂孵箱中培養(yǎng)，每3天換液。此法利用解剖學(xué)獲取毛囊干細(xì)胞富集區(qū)對毛囊干細(xì)胞進(jìn)行分離。但獲得的毛囊干細(xì)胞純度不高。

3.6聯(lián)用顯微分離培養(yǎng)與免疫磁珠法[19]：顯微分離培養(yǎng)獲得毛囊隆突區(qū)細(xì)胞，應(yīng)用免疫磁珠純化毛囊隆突區(qū)細(xì)胞中CD200陽性的毛囊干細(xì)胞可獲得高純度毛囊干細(xì)胞，且細(xì)胞活性不受影響。1990 年，Morris等[20]應(yīng)用密度梯度離心方法分離小鼠表皮干細(xì)胞。因為用這種方法不能得到高純度的干細(xì)胞，后來很少有人再采用這種方法。

4毛囊干細(xì)胞的識別

4.1毛囊干細(xì)胞的組織學(xué)形態(tài)特征：毛囊干細(xì)胞在光鏡下呈立方形，細(xì)胞體積小，核漿比大，表面光滑，皺折少，又被稱為非鋸齒形細(xì)胞，細(xì)胞體積的增大與增殖能力呈負(fù)相關(guān)。超微結(jié)構(gòu)顯示胞內(nèi)含有大量游離核糖體而缺乏角蛋白纖維，細(xì)胞表面有少許微絨毛，細(xì)胞核存在許多卷曲，染色質(zhì)彌散分布，明顯不同于周圍的細(xì)胞，這些形態(tài)特征均表現(xiàn)出原始細(xì)胞的特性。倒置顯微鏡下觀察可見培養(yǎng)早期的細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)，表現(xiàn)為鋪路石狀；細(xì)胞大小一致，核大而明顯，多偏居于細(xì)胞一側(cè)，可見雙核細(xì)胞及分裂相細(xì)胞。細(xì)胞之間連接緊密，明顯分層，隨后增殖的細(xì)胞亦表現(xiàn)相同的形態(tài)。培養(yǎng)2周后，遠(yuǎn)離組織的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，逐漸伸長呈橢圓形，繼續(xù)培養(yǎng)可見細(xì)胞皺縮，胞漿內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒及細(xì)小空泡，細(xì)胞折光性降低，并有細(xì)胞裂解、死亡。

4.2標(biāo)記滯留細(xì)胞：毛囊干細(xì)胞最重要的特點之一就是慢周期性，而且可以有無限多次細(xì)胞周期[2]。當(dāng)暴露于帶有其他標(biāo)記的核苷酸例如[3H]-T 或BrdU時，細(xì)胞在DNA 合成的過程中攝取標(biāo)記核苷酸而將標(biāo)記整合于DNA中。4～8 周后快速分裂的短暫增殖細(xì)胞(transit amplifying cells，TAC)丟失了大量標(biāo)記，而由于干細(xì)胞的細(xì)胞周期長，這樣的標(biāo)記可以維持相當(dāng)長的一段時間，因此有人稱它為標(biāo)記滯留細(xì)胞(label-retaining cell，LRC)，是迄今為止識別毛囊干細(xì)胞最可靠的方法之一。這種方法由Bickenbach[21]1981年首先提出，現(xiàn)已成為公認(rèn)的識別毛囊干細(xì)胞的方法，并被當(dāng)作探索新的識別方法的參照標(biāo)準(zhǔn)。

4.3細(xì)胞克隆形成率：毛囊干細(xì)胞是毛發(fā)中的原始細(xì)胞，其分化經(jīng)[22]毛囊干細(xì)胞、TAC和有絲分裂后分化細(xì)胞(postmitotic differentiating cells，PDC) 三個階段[17]。用克隆形成能力來鑒別毛囊干細(xì)胞，大而活躍生長的克隆是干細(xì)胞形成的，僅分裂很少次數(shù)就進(jìn)入終末分化的細(xì)胞被認(rèn)為是TAC。細(xì)胞的集聚是由于其低運動性，反映了干細(xì)胞較TAC更大的細(xì)胞間粘附力，是整合素高水平表達(dá)的結(jié)果。

4.4毛囊干細(xì)胞標(biāo)記物：為了對毛囊干細(xì)胞進(jìn)行體外研究，尋找特異的干細(xì)胞標(biāo)記物對干細(xì)胞分離培養(yǎng)尤為重要，毛囊干細(xì)胞尚無特定的表面標(biāo)記物。目前已知高表達(dá)的分子有K15、K19、整合素、CD200及CD34等[23]，K19一般認(rèn)為毛囊的隆突部干細(xì)胞及胎兒、新生兒表皮基底層干細(xì)胞均表達(dá)K19， 成人無毛發(fā)皮膚如手掌、腳掌部位基底層的干細(xì)胞K19表達(dá)陽性，但有毛發(fā)皮膚基底層中的表皮干細(xì)胞K19表達(dá)為陰性而毛囊隆突部細(xì)胞K19表達(dá)為陽性，與LRC位置一致。雙重標(biāo)記研究證實，隆突部中K19陽性細(xì)胞是LRC，具有干細(xì)胞的慢周期性，但K19是否能標(biāo)記全部表皮干細(xì)胞仍有待進(jìn)一步研究[24]。毛囊隆突部中K15陽性細(xì)胞亦為LRC，并且表達(dá)整和素的水平明顯高于毛囊外根鞘周圍細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在毛囊干細(xì)胞分化過程中，K15表達(dá)減少較K19出現(xiàn)更早， 據(jù)此推斷K15表達(dá)量下降可能是細(xì)胞向TAC分化的最早征象之一，K15陰性而K19陽性的細(xì)胞可能是“早期”TAC，提示K15可能較K19在鑒別毛囊干細(xì)胞更有意義[25]。β1整合素表達(dá)于表皮基底層和毛囊隆突部。在人類的表皮，β1整合素的高水平表達(dá)是毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記，但并非所有的β1整合素陽性細(xì)胞都是干細(xì)胞，TAC也有表達(dá)。p63被認(rèn)為是毛囊干細(xì)胞的標(biāo)志之一。p63是腫瘤抑制因子之一，是p53的同族體，結(jié)構(gòu)和功能與之類似。Pellegrini等[26]發(fā)現(xiàn)在角膜緣的基底細(xì)胞有p63表達(dá)，而在角膜表面的TAC沒有p63表達(dá)，因而認(rèn)為p63是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物，但p63在毛發(fā)基質(zhì)中亦有表達(dá)。CD34是造血干細(xì)胞特異性標(biāo)記物，最近研究發(fā)現(xiàn)其在隆突部高表達(dá)[27]，在鼠毛囊中檢測發(fā)現(xiàn)CD34與LRC和K15陽性細(xì)胞在毛囊處位置一致。Trempus提出CD34可能是鼠毛囊干細(xì)胞最特異的標(biāo)記物[28]，盡管CD34也在真皮細(xì)胞中表達(dá)，但CD34是細(xì)胞表面蛋白，應(yīng)用抗CD34抗體標(biāo)記可通過熒光激活細(xì)胞分類法收集活性隆突部細(xì)胞，但有研究表明在人毛囊隆突部中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)下降或缺失，而CD200 陽性細(xì)胞表現(xiàn)出更高的克隆形成率[29]，在鼠毛囊外根鞘細(xì)胞中也有CD200 表達(dá)[30]。CD200 是一種I型膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族，受體表達(dá)在巨噬細(xì)胞表面及T細(xì)胞亞群上[31]。CD200與CD200受體間的相互作用可以傳遞抑制性信號減低髓樣細(xì)胞的活性，改變其遷移，在免疫疾病和抑制排斥反應(yīng)中作為一種免疫耐受信號[32]， 提示未來幾年對于人毛囊及毛囊干細(xì)胞的免疫研究將成為新的熱點[33]。單克隆抗體C8/ 144B，最初用于抗T細(xì)胞蛋白CD8的羧基末端肽，可選擇性地表達(dá)于毛囊隆突部的角質(zhì)形成細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群。在C8/144B染色陽性部位，β1整合素、K15和K19均陽性表達(dá)，故單克隆抗體C8/144B被認(rèn)為是識別毛囊干細(xì)胞的一個標(biāo)記物[34]。單克隆抗體H4僅表達(dá)于毛囊隆突部，亦被認(rèn)為是毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記物之一。在分離純化毛囊干細(xì)胞前加入以上標(biāo)記物的相應(yīng)抗體并染色，分離純化后應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交、熒光標(biāo)記識別及同焦點顯微鏡檢測法已成為對毛囊干細(xì)胞進(jìn)行識別鑒定的主要方法。

4.5 RT-PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用[12，35]：抽提分離得到細(xì)胞總的mRNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，在特定的條件下對毛囊干細(xì)胞的標(biāo)記物如K15、K19等進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，所得產(chǎn)物電泳條帶與Marker 條帶位置進(jìn)行比較，判斷細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物的含量。此方法也可對體外培養(yǎng)干細(xì)胞傳代情況的判斷。

對毛囊干細(xì)胞的識別目前沒有公認(rèn)的特異的方法，因此需要聯(lián)合應(yīng)用以上方法對分離純化的毛囊干細(xì)胞進(jìn)行識別并對毛囊干細(xì)胞體外傳代情況進(jìn)行檢測。

5問題與展望

目前對于毛囊干細(xì)胞的研究已取得的了很大進(jìn)步，但對分離純化及識別方法的研究仍存在著許多問題：

5.1沒有規(guī)范的分離純化方法，分離純化毛囊干細(xì)胞的純度不足：目前分離純化毛囊干細(xì)胞的技術(shù)較多，但沒有公認(rèn)的純度高的分離純化方法，應(yīng)用目前常用分離純化的方法分離毛囊干細(xì)胞的純度大約在50%～90%之間[13]，組織塊法分離的毛囊干細(xì)胞純度較低，約在50%左右，應(yīng)用差速貼壁法純化毛囊干細(xì)胞可獲得純度為90%以上的毛囊干細(xì)胞[16]。

5.2 分離的毛囊干細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)幾代后其增殖能力下降[13]：消化法獲得的干細(xì)胞經(jīng)歷倍增期后，生長速度減慢，進(jìn)入平臺期。免疫組化染色和克隆形成率結(jié)果顯示，第3 代、7 代組織塊法免疫組化陽性率和克隆形成率明顯高于消化法，兩種方法之間差異極顯著(P<0.01)。從傳代次數(shù)來看，消化法第12代細(xì)胞已出現(xiàn)老化現(xiàn)象，其原因可能是酶消化破壞了干細(xì)胞與微環(huán)境的聯(lián)系，影響了干細(xì)胞的生物學(xué)特性。

5.3標(biāo)記物的選擇：毛囊干細(xì)胞雖然有多種標(biāo)記物，但缺乏特異性。一般認(rèn)為β1-整合素陽性細(xì)胞包含了干細(xì)胞和早期TAC[36]；在毛囊生長期K19陽性細(xì)胞不僅大量表達(dá)于毛囊隆突部，也存在于其下方的毛球部，進(jìn)入退行期和靜止期，隨著毛球部萎縮， K19 陽性細(xì)胞消失，而毛囊外根鞘部位依然存在K19 陽性細(xì)胞。因此，只能通過聯(lián)合使用標(biāo)記物以提高特異性。

5.4加入干細(xì)胞標(biāo)記物相應(yīng)抗體后進(jìn)行傳代是否會影響其增殖能力：目前，還沒有關(guān)于加入毛囊干細(xì)胞相應(yīng)抗體后是否影響其增殖能力的報道，但這些標(biāo)記物本身是毛囊干細(xì)胞的組成成分，在細(xì)胞的增殖和分化過程中起一定作用，當(dāng)我們應(yīng)用其相應(yīng)抗體與之結(jié)合時必將影響標(biāo)記物作用的發(fā)揮，有可能會影響毛囊干細(xì)胞的體外增殖與傳代的能力。

隨著研究的深入，相信在不久的將來定能解決上述問題，應(yīng)用純度高、增殖能力強(qiáng)的毛囊干細(xì)胞在特定的條件下進(jìn)行分化并應(yīng)用于臨床。

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[收稿日期]2008-05-22[修回日期]2008-07-28

編輯/李陽利